Identificación de los perfiles de expresión en el adenocarcinoma ductal de páncreas. Implicaciones clínicas

INTRODUCCIÓN: El cáncer de páncreas es la cuarta causa de muerte por cáncer en el mundo occidental, con una incidencia de 8-10 casos por 100.000 habitantes/año. A pesar de los esfuerzos científicos y el progreso significativo en la comprensión de las bases moleculares del adenocarcinoma de páncreas (ACP), la supervivencia no ha cambiado mucho en los últimos 20 años. El pronóstico de estos pacientes continúa siendo insatisfactorio debido al diagnóstico tardío, las bajas tasas de resecabilidad y la resistencia a la quimioterapia. Nuevas estrategias terapéuticas son necesarias para mejorar el pronóstico de los pacientes con ACP. La profundización en nuestro conocimiento sobre la biología molecular de esta entidad puede tener implicaciones clínicas importantes en la estratificación del riesgo de un paciente, el diagnóstico temprano e incluso el manejo terapéutico. En el ACP se han observado distintas alteraciones genéticas que incluyen la afectación de oncogenes y genes supresores como K-ras, HER-2/neu, p16, p53 y DPC4. La prevalencia de estas alteraciones aumenta según el grado de displasia de las lesiones ductales. Tratamientos cuya diana sean estas anomalías moleculares suponen una gran promesa para el tratamiento del ACP en un futuro no muy lejano. El ACP, al igual que otros tipos de cáncer, se caracteriza por múltiples cambios en la expresión génica. El conocimiento genético actual sobre el ACP se basa en perfiles de expresión de genes aislados, conociéndose poco las interrelaciones existentes entre ellos. Para poder definir el ACP en términos moleculares, es necesario llevar a cabo un análisis sistemático de la expresión génica. HIPÓTESIS La hipótesis de este trabajo supone la existencia de diferentes patrones de expresión génica en el ACP que determinarían la agresividad y la evolución de la enfermedad y que, por tanto, se podrían correlacionar con el tiempo de supervivencia. Este trabajo pretende investigar estos diferentes patrones de expresión y, al igual que en otros tipos de tumores, relacionarlos con la evolución clínica de los pacientes. OBJETIVOS: Los objetivos concretos son: 1. Caracterizar el perfil o perfiles de expresión genética presentes en el adenocarcinoma ductal pancreático 2. Clasificar los diferentes patrones de expresión obtenidos. 3. Correlacionar estos patrones con la supervivencia. El objetivo último del trabajo será la mejora en el conocimiento de las alteraciones moleculares en el ACP para contribuir al progreso de la investigación básica y clínica en el cáncer de páncreas y ayudar a mejorar su tratamiento y pronóstico. MATERIAL Y MÉTODOS: 1. Diseño del estudio: diseño de cohorte con seguimiento de los pacientes desde el momento del diagnóstico hasta su defunción o hasta el momento de realizar el análisis genético. 2. Identificación y selección de pacientes y muestras histológicas: pacientes intervenidos por cáncer de páncreas y resecados por el equipo investigador entre 1998 y 2010. El seguimiento clínico de los pacientes fue realizado por los servicios de oncología médica y cirugía digestiva mediante los controles clínicos y analíticos habituales. Sobre esta serie se localizó el material histológico en parafina disponible en el servicio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico Universitario de Valencia y los casos fueron revisados para confirmar el diagnóstico y descartar aquellos casos con un tipo histológico tumoral diferente al adenocarcinoma. Sobre esta serie de casos se buscó y clasificó todo el material en parafina del que se disponía y se seleccionó un bloque representativo por cada caso. 3. Base de datos de casos: se confeccionó una base de datos incluyendo los siguientes parámetros: edad, sexo, tamaño del tumor, número de ganglios resecados, número de ganglios afectos, invasión vascular, invasión perineural, estatus del margen de resección, estadio y tiempo de supervivencia. 4. Microdisección láser: para obtener muestras de tejido tumoral puro o con el mínimo posible de tejido y células no tumorales se realizó microdisección del tejido tumoral. El microscopio de disección laser utilizado fue AS-LMD Laser Microdissection System (Leica Microsystems). 5. Obtención de ARN: para la optimización de los métodos para la obtención de ARN de la mejor calidad posible se probaron 2 kits diferentes de extracción de ARN, obteniéndose ARN menos degradado con High Pure FFPE RNA Micro Kit de Roche. 5.1. Comprobación de la degradación del ARN: se comprobó la calidad y cantidad de ARN de todos los casos para comprobar que eran suficientes. Para comprobar la calidad del ARN y la posible degradación del mismo se verificó en gel de agarosa y en bioanalizador. Los resultados mostraron que el ARN estaba muy degradado, como era de esperar, al no poderse identificar los picos correspondientes a los ARNs ribosómicos y detectarse que todo el ARN estaba fragmentado. 5.2. Amplificación del ARN: dado que la cantidad de ARN obtenido era insuficiente para ser analizado mediante los microchips seleccionados (“HumanHT-12 v4 Expression BeadChip Illumina), se amplificó el ARN mediante un sistema que mantiene las proporciones de cada uno de los ARNs en la muestra y permite obtener cantidad de ARN suficiente como para poder utilizar dichos chips. El kit empleado fue el kit “Sensation TM RNA Amplification kit” de Genisphere, usando un protocolo específico para muestras obtenidas de parafina en el cual se utilizaban 10ng de ARN para obtener más de 1.000 ng en total. Este extremo se comprobó en 12 muestras obteniéndose resultados totalmente fiables. 6. Análisis mediante microchips: todas las muestras seleccionadas fueron analizadas mediante el microchip HumanHT-12 v3 Expression BeadChip que utiliza el sistema DASL HT FFPE ASSAY KIT (ambos de Illumina) http://support.illumina.com/array/array_kits/humanht-12_v4_expression_beadchip_kit.ilmn. 7. Estudio estadístico: el análisis de los microarrays de expresión fue realizado mediante el paquete Beadarray para identificar la posible asociación entre los niveles de ARN de todos los genes estudiados y la supervivencia (menor o mayor de 24 meses) de los pacientes mediante diferentes estrategias: Según supervivencia mayor o menor de 24 meses. Selección de muestras con estadio 2B, y comparar según supervivencia. Comparación según afectación del margen retroperitoneal con la supervivencia. Selección de las 10 muestras de los pacientes con más supervivencia y las 10 con menos supervivencia e identificación de los genes que se relacionen con esta situación. Por último, se realizaron los estudios estadísticos específicos mediante el programa Limma, para la determinación de perfiles de expresión y estudio de los genes cuya expresión se encuentre alterada, correlación entre el perfil de expresión-periodo libre de enfermedad y supervivencia e identificación de los genes o sistemas funcionales que puedan tener una mayor relevancia. RESULTADOS 1. Datos clínicos: de los 76 pacientes que habían sido incluidos, 11 de ellos fueron excluidos por diversos motivos (material deteriorado, insuficiente cantidad tumor u otro componente tumoral asociado). Entre los 65 pacientes que fueron incluidos finalmente, la media de edad fue de 64,5 años, con un rango entre 42 y 81 años. El 63% de los pacientes eran hombres. El seguimiento medio fue de 24,7 meses con una mediana de 18 meses. Los tumores resecados tenían un tamaño medio de 3,03 cm (con un rango entre 1 y 7 cm). El número medio de adenopatías aisladas en cada pieza fue de 8,15 adenopatías, con una mediana de 10 ganglios por paciente y una media de afectación metastásica de 1,85 (con una variación entre 0 y 17). El LNR medio fue de 0,16. Se detectó invasión linfovascular en 41 casos (63%) y perineural en 45 casos (69%). El margen retroperitoneal estaba afecto en 28 casos (43%). 2. Normalización de los resultados: se ajustó el ruido de fondo y se normalizaron de los datos para permitir la comparación de los resultados entre unos microchips con otros. 3. Clustering: con estos datos hemos estudiado la posible agrupación de las muestras formando “clustering” en base a los resultados obtenidos para ver homologías y diferencias entre ellas. Para esto hemos utilizado las 4 estrategias mencionadas anteriormente. En la primera estrategia de análisis, supervivencia mayor o menor de 24 meses, se obtuvieron 36 muestras válidas para su análisis. Para la segunda estrategia (pacientes con estadio IIb) se obtuvieron 16 muestras válidas. Para la tercera comparación según la afectación del margen retroperitoneal, se obtuvieron 37 muestras válidas. Finalmente para la última estrategia, comparación de muestras de los 10 pacientes con mayor supervivencia frente a los 10 pacientes con menor supervivencia, se utilizaron 20 muestras válidas. Los resultados muestran que los niveles de ARNm de numerosos genes presentan una asociación con los niveles de supervivencia con valores de p del orden de 10-4. Sin embargo, estos valores de p se obtienen de comparar cada gen de manera independiente. Es por ello que al ajustar el valor de p para comparaciones múltiples, este valor no resulta ser significativo. DISCUSIÓN El cáncer de páncreas supone uno de los mayores retos oncológicos de la actualidad. Las peculiaridades que presenta el cáncer de páncreas para la obtención de ARN son problemas específicos y únicos de este órgano: los altos niveles de ARNasas y otras enzimas pancreáticas así como la baja celularidad neoplásica de la mayoría de estos cánceres. El contenido de ARNasas podría interferir en la extracción de ARNm pero son un producto de secreción de las células acinares, las cuales se pierden en las neoplasia por atrofia o destrucción. Las piezas de resección por ACDP están compuestas de una minoría de células epiteliales tumorales rodeadas de un estroma no neoplásico fibroso denso predominante, que contiene fibroblastos activos, vasos pequeños, células inflamatorias y componentes atróficos residuales atrapados de los órganos invadidos, una característica casi exclusiva del ACDP. La microdisección es un método que permite la purificación del componente epitelial para realizar estudios de perfiles de expresión. La extracción de ARN en tejidos parafinados supone un reto importante, ya que el ARN es muy sensible y se degrada fácilmente. Es por ello que la mayoría de estudios se realizan sobre tejido congelado. Sin embargo, el número de piezas de resección y la disponibilidad de tejido congelado pancreático a veces está limitada y requiere mucho tiempo para conseguir un tamaño muestral amplio. Por el contrario, las muestras en parafina son la herramienta común de uso en todos los laboratorios de anatomía patológica, por lo que la disponibilidad de éstas es mucho más amplia. Actualmente se disponen de kits comerciales que permiten la extracción de ARN de muestras parafinadas. Otro problema añadido es la escasa cantidad de ARN obtenido mediante microdisección. Esto puede ser solventado con métodos de amplificación, los cuales no introducen errores significativos, ya que mantienen las proporciones obtenidas. El número de estudios publicados en la literatura internacional sobre perfiles de expresión del ACDP ha crecido de forma exponencial en los últimos años. Estas publicaciones han generado un número considerable de genes diferencialmente expresados en el ACDP. Estos estudios han utilizado tejidos tumorales y sanos al completo, células ductales microdisecadas, líneas celulares y xenotransplantes. Además, no sólo se han estudiado las diferencias entre el tejido sano y tumoral sino que también se han estudiado las diferencias de expresión con el estroma y con otras entidades no neoplásicas como la pancreatitis crónica, la cual supone uno de los diagnósticos diferenciales más difíciles e importantes del ACDP. En este trabajo aunque no hemos conseguido identificar patrones de expresión que se relacionen de forma estadísticamente significativa con la supervivencia, hemos identificado una serie de genes que pudieran estar relacionados con una mayor o menor supervivencia. Entre ellos, nos parecen especialmente relevantes algunos genes como MTHFD2, OSBPL7, SYTL2, CCL24, CA 9, SHROOM2, KIAA0513, FAM134B, OPA3, PMP22, TUBB3, FOXD4, CEACAM1, GPR177, OSR1, USP47, ANKS4B, DCUN1D3, o PPFIA2, y en particular estos tres: Tenascin C, TFAP2A, Maspin, que han sido descritos en el ACDP CONCLUSIONES Los hallazgos del presente estudio muestran que existe una gran variabilidad en los perfiles de expresión génica en el ACDP, a pesar de haberse seleccionado de forma estricta las muestras y haberse obtenido sólo material tumoral mediante microdisección. Estos resultados poco alentadores podrían cuestionar la relevancia biológica de la búsqueda de perfiles de expresión en el ACDP como un método predictivo para la supervivencia de los pacientes debido a que el perfil de expresión de cada tumor en particular es muy específico. Sin embargo, podría ser un problema que tuviese más relación en la forma de clasificar los tumores, de manera que podrían existir perfiles más claros seleccionando dentro de los ACDP aquellos con mutaciones de un gen determinado, un estadio concreto, un grado de extensión tumoral determinado, etc. al igual que habría que tener en cuenta esa expresion diferencial entre la diferentes regiones de un mismo tumor. Los resultados obtenidos muestran que existe una gran diversidad entre los diferentes tumores a pesar de su homogeneidad histológica y la inclusión de un paso de selección exclusivamente de tejido tumoral para evitar el ruido que puedan producir otras células contenidas en el tumor, fundamentalmente el estroma que acompaña a este tipo de tumor. Pese a ello, la variabilidad de los tumores no ha permitido la detección de un perfil de expresión estadísticamente significativo asociado a la supervivencia en pacientes con ACDP. A diferencia de los estudios previos de perfiles de expresión en los que se utilizaba material congelado, nosotros hemos utilizado tejido parafinado, lo que abre un nuevo camino a la investigación en este campo al permitir hacer estudios retrospectivos utilizando un material de uso cotidiano en los servicios de anatomía patológica y de fácil disponibilidad y amplio número. Los resultados obtenidos muestran que no existe un perfil claro (altamente significativo) de genes cuyos niveles de ARNm en el tumor sean determinantes para poder predecir la supervivencia de los pacientes. No obstante, la identificación de genes relacionados con una mayor supervivencia aunque con valores de p inferiores a 10-4, sugiere que pueden tener alguna implicación, extremo que debería ser verificado en una muestra más amplia. Entre estos genes, algunos se han sido identificado y estudiado en otros tipos tumorales como MTHFD2, OSBPL7, SYTL2, CCL24 y CA9 que también podrían ser de gran utilidad clínica. También hemos identificado genes relacionados con la angiogénesis, el desarrollo axonal, el ciclo celular o la diferenciación celular como SHROOM2, KIAA0513, FAM134B, OPA3, PMP22, TUBB3, FOXD4, CEACAM1, GPR177, OSR1, USP47, ANKS4B, DCUN1D3 y PPFIA2. Por último, genes especialmente interesantes como la Tenascina C, TFAP2A o Maspin que parecen tener un papel importante en la carcinogénesis del ACDP podrían constituir futuras dianas tanto diagnósticas como terapéuticas