Estudio de la diversidad y evaluación de las relaciones fenotipo-genotipo para la búsqueda de cepas malolácticas de Oenococcus oeni

El vino es una bebida obtenida por fermentación del mosto de uva. Durante la fermentación participan las levaduras y las bacterias lácticas que son responsables de la fermentación alcohólica y maloláctica, respectivamente. La fermentación alcohólica consiste fundamentalmente en la transformación de los azúcares del mosto en etanol y CO2, mientras que la fermentación maloláctica consiste en la conversión de ácido málico, propio del mosto, en ácido láctico y CO2. De todas las especies de bacterias lácticas relacionadas con la vinificación, Oenococcus oeni es la responsable generalmente de la FML, ello se debe a que es la que mejor tolera las condiciones estresantes del vino. Por esta razón, es la especie que más se utiliza para la fabricación de cultivos malolácticos. Los objetivos de esta tesis han sido estimar la diversidad intraespecífica de la especie O. oeni, determinar si existen o no diferencias entre aislados procedentes de mosto y vino, evaluar la existencia de relaciones entre características fenotípicas/tecnológicas y genómicas, seleccionar adecuadas cepas malolácticas y determinar el comportamiento de diferentes tipos de cepas frente al estrés. Para ello, se han evaluado las capacidades de 104 aislados para fermentar diferentes carbohidratos, hidrolizar la arginina, producir exopolisacáridos, degradar ácidos orgánicos, producir aminas biógenas, y se ha determinado la existencia de enzimas como β glicosidasas, β-glucanasas, celulasas, esterasas, lipasas y tanasas en los mismos. También se han estudiado sus capacidades tecnológicas mediante la evaluación del crecimiento en vino tinto natural y en vino sintético a diferentes valores de pH, diferentes concentraciones de etanol y de SO2. A nivel molecular se han tipificado los aislados mediante RAPD y VNTR, se han secuenciado parcialmente sus genes rpoB y rpoC y se ha investigado la presencia/ausencia de 16 marcadores moleculares en los mismos. A nivel transcriptómico se han estimado los niveles de expresión de los genes cfa, clpP, ctsR, hsp18, rmlbB y txrA, que se han descrito relacionados con la respuesta al estrés frente al pH, etanol y SO2. Cuando se consideran las características fenotípicas, tecnológicas y genómicas conjuntamente, se observa que los 104 aislados constituyen 104 cepas diferentes y que el índice de diversidad D encontrado en este conjunto de cepas es de 1, el máximo posible. Se ha observado que a nivel fenotípico existen diferencias importantes entre cepas aisladas de mosto y de vino, pero sobre todo a nivel tecnológico. No se han encontrado relaciones claras entre las características fenotípicas/tecnológicas y genómicas, aunque si se observan ciertas tendencias entre la presencia de algunas características genómicas y el origen de las cepas (mosto o vino), así como entre esto último y la presencia de ciertas actividades enzimáticas. De un total de 104 aislados se han seleccionado las cepas 205A, 229 y 504 como las más adecuadas para ser utilizadas como cultivos malolácticos, ya que son capaces de sobrevivir y crecer en vino tinto, degradan eficaz y rápidamente el ácido málico, estas cepas son incapaces de producir aminas biógenas y presentan actividades enzimáticas de interés, tales como β glicosidasa, β glucanasa y celulasa; además la cepa 504 es capaz de resistir a valores bajos de (pH 2.9) y altos niveles de etanol (15 %) y SO2 (60 mg/L), mientras que las otras dos muestran resistencias intermedias a estos últimas características. Se han observado diferentes comportamientos en la expresión de genes de estrés entre cepas aisladas de diferentes momentos de la vinificación, y entre cepas resistentes y sensibles. El único gen que se sobreexpresa significativamente, es el hsp18 en condiciones de estrés por etanol y por bajo pH.Wine is a beverage made from fermented grapes. Two main groups of organisms involved in the production of wines are yeasts and lactic acid bacteria (LAB); they are responsible for alcoholic fermentation (AF) and malolactic fermentation (MLF), respectively. The AF consists in the transformation of sugars into ethanol and carbon dioxide. In MLF process L-malic acid present in wine is converted into L-lactic acid and carbon dioxide. Among lactic acid bacteria associated to winemaking process, Oenococcus oeni is the responsible of the MLF and is the most adapted specie to wine stress conditions. For this reason is used as a malolactic starter culture. The aims of this work were to estimate the intraspecific diversity of this specie, to determine whether there are differences between isolates from must and wine, to assessing the existence of relationships between phenotypic/technological and genomic characteristics, to select suitable malolactic strains and to determinate the behaviour of different kind of strains to stress. For this, 104 strains were evaluated by analysing their abilities to metabolize several carbon sources, arginine hydrolyse, exo-polysaccharides production, organic acids degradation, biogenic amines production, detection of enzymes such as β glucosidase, β-glucanase, cellulase, esterase, lipases and tannase. Technological characteristics also were studied by assessing the growth in red wine and synthetic wine at different pH values, concentrations of ethanol and SO2. At molecular level the isolates were typified by RAPD and VNTR, and rpoB and rpoC genes were partially sequenced and the presence or absence of 16 molecular markers was investigated. At transcriptomic level, the expression of cfa, clpP, ctsR, hsp18, rmlbB y txrA genes were estimated and these genes had reported as a relating to the stress response against pH, ethanol and SO2. When considering the phenotypic, genomic and technology characteristics together, the 104 isolates are 104 different strains and the diversity index D found in this set of strains is 1, the maximum possible. It has been observed that at the phenotypic level there were important differences between isolates of must and wine, but especially at technologic level. Not found clear relationships between phenotypic/technological and genomic features, although certain trends between the presence of some genomic characteristics and origin of the strains (must or wine) are observed, and between the latter and the presence of certain enzyme activities. Among 104 isolates have been selected 205A, 229 and 504 strains as the most suitable for use as malolactic cultures, since they were able to survive and grow in red wine, degrading efficiently and rapidly malic acid, displayed enzymatic activities of interest, such as β-glycosidase, β-glucanase and cellulase and none of the three strains were able of produce biogenic amines; strain 504 also is capable of withstanding at low values (pH 2.9) and high levels of ethanol (15 %) and SO2 (60 mg/L), while the other two showed intermediate resistance to these characteristics. Different behaviors have been observed in gene expression of stress between strains isolated from must and wine, and between resistant and susceptible strains. The hsp18 gene was the only one that significantly over-expressed in ethanol and low pH stress conditions