Profundización en la caracterización funcional de las isoformas glicolíticas de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Arabidopsis

La glicólisis es una ruta metabólica que se encuentra, al menos en parte, en todos los organismos vivos, y es una de las primeras grandes rutas cuyas enzimas fueron identificadas y caracterizadas a nivel bioquímico. En los últimos años, se ha demostrado que las enzimas que participan en la glicólisis están también implicadas en otros procesos como por ejemplo en la señalización celular. En esta tesis doctoral, ha sido el objeto de nuestro estudio las isoformas glicolíticas de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) fosforilativa de Arabidopsis thaliana. Las distintas isoformas de esta enzima participan en el ciclo de Calvin en los cloroplastos, y en la glicólisis en el citosol y en los plastos. Demostramos que todas las isoformas glicolíticas de la GAPDH (GAPC y GAPCp) son más abundantes en las raíces que en las partes aéreas, lo que nos llevó a postular que la glicólisis podría ser un proceso menor en la parte aérea, o al menos en las células fotosintéticas en condiciones luminosas donde sería un proceso antagonista a la fotosíntesis. Además, la ausencia de unas isoformas no está compensada con una sobreexpresión de otras. Demostramos igualmente mediante una caracterización morfológica y metabólica de mutantes dobles que las enzimas GAPCps contribuían más al metabolismo y al desarrollo de Arabidopsis que las GAPCs. Se había demostrado previamente que la GAPDH glicolítica plastidial (GAPCp) es esencial para el desarrollo de la raíz y de las microsporas. Sin embargo, faltaba aún conocer la contribución específica de esta enzima en el metabolismo de la raíz y sobre todo su posible función en la parte aérea. Para ello se expresó la GAPCp1 en los mutantes dobles de la GAPCp bajo el control de promotores específicos de células fotosintéticas (promotor de la RuBisCo) o de las raíces (promotor del transportador de fosfato PHT1.2). La expresión de la GAPCp en células fotosintéticas de las hojas no afectó al desarrollo de la parte aérea ni a su perfil metabólico. Sin embargo la expresión de la GAPCp bajo el control de PHT1.2 aumentó el número de raíces laterales y tuvo un efecto importante en el metabolismo y desarrollo de la parte aérea. Estos resultados indican que la GAPCp1 no tiene significación funcional en las células fotosintéticas pero juega un papel fundamental en las raíces, y probablemente en otras células heterotróficas de la parte aérea. En las raíces, la actividad específica de la GAPCp1 podría requerirse en los meristemos y en las células de la caliptra, donde sería esencial para el crecimiento de la raíz primaria, que a su vez contribuiría al crecimiento del resto de la planta. Un estudio transcriptómico y metabolómico con mutantes condicionales de la GAPCp nos permitió identificar las dianas primarias génicas y metabólicas de la actividad de la enzima. Así pues, pudimos determinar que la glutamina, el glicerato y el galactinol eran las dianas metabólicas primarias de la GAPCp, lo que nos llevó a concluir que la glutamina y el glicerato podrían ser los metabolitos que responden directamente a la actividad de la enzima participando en el restablecimiento de la homeostasis metabólica, mientras que el galactinol sería un indicador de estrés consecuencia de la falta de actividad de la GAPCp que podría participar en la respuesta al estrés oxidativo. A nivel génico, identificamos los genes de una lisina descarboxilasa (At5g06300; LOG7) y de una glutamato descarboxilasa (At5g17330; GAD) como posibles dianas primarias de la actividad de la GAPCp1. GAD es un nexo metabólico entre el metabolismo del carbono y del nitrógeno y esto podría ser la clave para explicar las desregulaciones que sufren las plantas mutantes dobles de la GAPCp. Nuestros resultados indican que la GAPCp podría ser un conector de redes metabólicas clave como por ejemplo de glicólisis con la ruta fosforilativa de biosíntesis de serina, la ruta de asimilación del amonio o el metabolismo del ácido gamma aminobutírico. Para manipular el metabolismo de la planta es necesario entender de forma precisa las redes metabólicas de las plantas y su forma de interconexión. Los resultados presentados en esta tesis doctoral abren nuevas direcciones para la investigación sobre los mecanismos moleculares que conectan estas redes metabólicas en las plantas.Glycolysis is a metabolic pathway which is present, at least in part, in all living organisms, and is one of the major pathways which enzymes have been biochemically identified and characterized. In recent years, it has been demonstrated that enzymes which take part to glycolysis were also implicated in other processes, like for example cell signaling. In this doctoral thesis, we have studied glycolytic isoforms of the phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in Arabidopsis thaliana. The various isoforms of this enzyme participate in Calvin cycle into chloroplasts, and in glycolysis into the cytosol and plastids. We demonstrated that all GAPDH glycolytic isoforms (GAPC and GAPCp) are more abundant in roots than in aerial parts, so we postulated that glycolysis could be a minor process in aerial parts, or at least in photosynthetic cells in light conditions where it would be antagonistic to photosynthesis. Besides, the lack of one of the isoforms was not compensated by an overexpression of the others. We also demonstrated via a metabolic and morphological characterization of double mutants that GAPCps enzymes contributed more to Arabidopsis metabolism and development than did GAPCs. It has been previously demonstrated that plastidial glycolytic GAPDH (GAPCp) is essential for root growth and microspore development. However, the specific contribution of this enzyme to root metabolism and especially its potential role in the aerial part has not been unraveled yet. For this purpose, we expressed the enzyme in double gapcp mutants under the control of photosynthetic (RuBisCO) or root (PHT1.2) cell specific promoters. Expression of GAPCp in leave photosynthetic cells did not have any effect on the aerial part metabolic profile or growth. However, expression of GAPCp1 under the control of PHT1.2 promoter clearly affected Arabidopsis development, by increasing the number of lateral roots and having a major effect on the aerial part growth and metabolic profile. Our results indicate that GAPCp1 is not functionally significant in photosynthetic cells but has a fundamental role in roots and probably in other heterotrophic cells of the aerial part. Specifically, GAPCp activity may be required in root meristems and root cap for proper primary root growth, which in turn would contribute to the growth of the rest of the plant. Performing a transcriptomic and metabolomic study on GAPCp conditional mutants, we were able to identify metabolic and genomic primary targets responding to GAPCp activity. Metabolic primary targets were glutamine, glycerate and galactinol. We postulate that glutamine and glycerate are the metabolite whose levels are primarily responding to GAPCp activity and are participating in the reestablishment of metabolic homeostasis while galactinol is the stress indicator generated by the lack of GAPCp activity that could participate in the response to oxidative stress. Genomic primary targets were a lysine decarboxylase (At5g06300; LOG7) and a glutamate decarboxylase (At5g17330; GAD). GAD is a metabolic link between carbon and nitrogen metabolism that could be a key to explain deregulations that occur in GAPCp double mutants plants. Our results indicate that GAPCp could be a key metabolic connector of pathways such as the phosphorylated pathway of serine biosynthesis, the ammonium assimilation pathway or the metabolism of gamma-aminobutyric acid. Manipulation of plant metabolism needs to precisely understand plant metabolic networks and how they are interconnected. The results presented in this doctoral thesis open new directions for research on the molecular mechanisms connecting plant metabolic networks