Desarrollo de herramientas bioinformáticas aplicadas al Diagnóstico Genético mediante Secuenciación Masiva

La extraordinaria evolución tecnológica de una nueva generación de plataformas de secuenciación, que reciben el nombre de ‘Next-Generation Sequencing’ o NGS, unida al desarrollo de sistemas de captura de regiones específicas del genoma han permitido superar las limitaciones técnicas y económicas que impedían realizar el cribado de un gran número de genes o incluso del exoma completo de manera rutinaria. El análisis de los datos procedentes de este tipo de estudios es complejo no solo por la enorme cantidad de información que se genera por muestra sino también por las peculiaridades asociadas a cada una de las combinaciones posibles entre plataforma de secuenciación y sistema de captura. Actualmente, existe un amplio abanico de posibles piezas de software orientadas a resolver pasos muy concretos del extenso flujo de análisis necesario para el procesamiento de este tipo de datos. Sin embargo, la combinación de diferentes herramientas así como la elección de diferentes parámetros en su ejecución producen resultados muy dispares ofreciendo distintos grados de incertidumbre en los resultados cuya repercusión debe ser determinada para poder trasladar a la práctica clínica este tipo de tecnologías. Esta tesis muestra el desarrollo y la validación de diferentes protocolos de trabajo para el análisis integral de datos procedentes de estudios de resecuenciación dirigida mediante tecnologías NGS a partir de muestras controladas con el objetivo de identificar las variables más importantes del sistema en estudio y describir un método robusto y eficiente de análisis que permitan realizar un diagnóstico sólido. Las diferentes rutinas de trabajo generadas abarcan desde el análisis inicial del dato bruto hasta la identificación de las mutaciones causantes de la enfermedad o la priorización de genes candidatos. El primero de los protocolos desarrollados fue aplicado al estudio del exoma completo de un individuo con Anemia de Fanconi cuyo diagnóstico, tras la secuenciación de varios genes por Sanger, seguía siendo una incógnita. A través del análisis del exoma de este único individuo fue posible identificar un nuevo gen responsable de su enfermedad demostrándose así no solo la eficiencia de sistema de análisis desarrollado sino también la idoneidad de esta técnica en este tipo de casos. Este mismo protocolo actualizado fue aplicado con éxito en el análisis de un panel de genes diseñado ‘ad hoc’ para el diagnóstico de diferentes cardiomiopatías en un grupo controlado de pacientes demostrando su idoneidad en este tipo de enfermedades, difícilmente abordables por técnicas tradicionales desde el punto de vista económico debido a su alta heterogeneidad genética. Finalmente, una nueva adaptación de este último protocolo a los datos procedentes de mini-secuenciadores con tecnología NGS demostró su idoneidad y precisión en el estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 en un grupo de muestras control. Paralelamente, esta tesis hace una profunda reflexión sobre la aplicación de la secuenciación masiva al Diagnóstico Genético señalando sus ventajas y limitaciones para su uso en las prácticas clínicas de rutinaria