El papel del ejercicio físico en la inducción de BDNF y sus vías de señalización en el sistema nervioso central. Aplicación neurobiológica en modelos sanos y terapéutica en la enfermedad de Alzheimer

La actividad física previene numerosas patologías y mejora muchos rasgos fisiopatológicos en diferentes enfermedades. El ejercicio ha sido asociado clásicamente con beneficios en desórdenes musculares y metabólicos. Sin embargo, los efectos del ejercicio en la función cerebral, especialidad conocida como “Neurobiología del ejercicio”, han cobrado gran importancia en los últimos años. Los efectos beneficiosos del ejercicio físico han sido establecidos en muchas enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer, el Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la esquizofrenia, el trastorno bipolar y los trastornos depresivos, entre otros. Estos hallazgos han llevado a utilizar el ejercicio físico como una estrategia terapéutica coadyuvante, no sólo en el campo de la investigación sino también en la práctica clínica. De acuerdo con una gran cantidad de evidencias, el ejercicio no sólo restaura las alteraciones fisiológicas de numerosas enfermedades neuropsiquiátricas sino que también mejora la función cerebral, la cognición y el estado psicológico de personas sanas a lo largo de la vida. El ejercicio físico ejerce su acción en el cerebro a través de diferentes vías moleculares y mecanismos fisiológicos. Algunas de ellas incluyen la prevención del estrés oxidativo, la liberación de endorfinas, el restablecimiento de la señalización dopaminérgica así como aquellas acciones mediadas por los factores neurotróficos, entre otros. Los factores neurotróficos son factores de crecimiento con diferentes fuentes y vías de acción. Aunque esta familia incluye numerosos factores, cabe destacar el factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el factor de crecimiento nervioso (NGF) y las neurotrofinas 3 y 4/5 (NT-3 y NT-4/5 respectivamente). Las principales acciones mediadas por estos factores incluyen la neurogénesis hipocampal, la reparación neuronal, axonogénesis, dendrogénesis y la modulación de la transmisión sináptica, lo que conduce a una mayor plasticidad cerebral. Las consecuencias funcionales de esta modulación incluyen una mejora en la potenciación a largo plazo en procesos relacionados con la memoria y el aprendizaje, así como efectos ansiolíticos y antidepresivos. De todos los factores neurotróficos estudiados, BDNF es uno de los más importantes ya que media efectos tróficos pleiotrópicos en el cerebro. Además, también es uno de los principales factores neurotróficos inducidos por ejercicio físico crónico y agudo. Se han encontrado altos niveles de BDNF en cerebros de personas entrenadas, a través de análisis post mortem y estudios in vivo utilizando sangre extraída de la yugular, así como en estudios con animales entrenados. Su inducción cerebral ocurre principalmente en el hipocampo y en el sistema límbico por lo que ha sido asociada con numerosas mejoras cognitivas y psicológicas. No existe todavía consenso sobre las condiciones adecuadas de procesamiento de la sangre para estandarizar la medida de BDNF periférico en estudios con ejercicio físico. Las muestras de suero, plasma, sangre total y plasma rico en plaquetas con diferentes condiciones de procesamiento son usadas indistintamente en la literatura. Esto lleva a encontrar inconsistencias entre los estudios. La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo clarificar, por un lado, los efectos del ejercicio agudo y el entrenamiento en los niveles de factores neurotróficos en sangre humana, así como el protocolo metodológico adecuado para el análisis de BDNF. Otro objetivo ha sido determinar las vías de señalización moleculares implicadas en los efectos beneficiosos del entrenamiento físico en dos modelos murinos para la enfermedad de Alzheimer. Por último, nos planteamos evaluar el posible efecto sinérgico beneficioso del ejercicio físico y un mimético farmacológico de BDNF en ratas sanas. En nuestro primer modelo experimental dividimos en dos grupos a adolescentes sanos de acuerdo a sus hábitos de ejercicio físico. El grupo entrenado incluía miembros de un equipo ciclista profesional, y por tanto altamente entrenados. El grupo control incluía sedentarios con las mismas características. Comparamos los niveles sanguíneos de IGF-1 y BDNF de ambos grupos en el periodo de pre-temporada y post-competitivo. Evaluamos el posible efecto del BDNF circulante en la activación de proteína de unión al elemento de respuesta al cAMP (CREB) en células sanguíneas mononucleares. Todos los participantes fueron también evaluados a través de análisis antropométricos, hematológicos y calorimétricos. Los niveles sanguíneos de BDNF e IGF-1 se mostraron incrementados en los adolescentes deportistas comparados con los controles sedentarios cuando se analizaron durante el periodo de pretemporada, caracterizado por implicar exigencias físicas moderadas. Este incremento no afectó a la activación de CREB. Las diferencias entre ambos grupos desaparecieron cuando se compararon los niveles de factores neurotróficos en el periodo post-competición, caracterizado por unas exigencias máximas en el rendimiento físico. En nuestro segundo modelo experimental determinamos el efecto de una sesión de ejercicio agudo en los niveles sanguíneos de BDNF en adultos sanos, bajo diferentes condiciones de procesamiento de las muestras en un análisis longitudinal (basal, inmediatamente al terminar el ejercicio y a los 30 y 60 minutos de recuperación). Las muestras sanguíneas que analizamos incluyeron el suero coagulado durante 10 minutos y 24 horas; plasma con EDTA, con y sin plaquetas; y sangre total. Encontramos un incremento de los niveles de BDNF tras la sesión de ejercicio agudo en las muestras de suero coagulado durante 24 horas y las de sangre total. Estos cambios no se evidenciaron cuando analizamos las muestras de suero coagulado durante 10 minutos, plasma total y plasma sin plaquetas. La interferencia de los anticoagulantes utilizados para el plasma y la irregular activación de las plaquetas en el suero coagulado 10 minutos produce una gran variabilidad en los niveles de BDNF. También encontramos que la temperatura de procesado de las muestras y la hemoconcentración son factores relevantes a tener en cuenta en estos estudios. En nuestro tercer modelo experimental utilizamos ratones no transgénicos y doble transgénicos (2xTg) para la enfermedad de Alzheimer. Dividimos los animales en dos grupos: sedentario y ejercicio. A los 10 meses de edad, los grupos entrenados fueron sometidos a 12 semanas de una combinación de entrenamiento forzado y voluntario. Sometimos a todos los animales a diferentes tests psicológicos y físicos. También determinamos el consumo de glucosa cerebral mediante tomografía por emisión de positrones y los marcadores bioquímicos relacionados con los niveles de β-amiloide (βA) (1-42) y su modulación a través de la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 1 (LRP1), la señalización de BDNF (niveles de tirosina quinasa B (TrkB) y la activación de CREB), daño oxidativo (malondialdehído, glutatión y carbonilación proteica), niveles de enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa dependiente de cobre/zinc y manganeso (Cu/Zn-SOD y Mn-SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT)), y el contenido (citocromo-C) y biogénesis mitocondrial (coactivador-1α del receptor activado de proliferación de los peroxisomas gamma, PGC-1α). El entrenamiento mejoró el comportamiento de los ratones 2xTg así como su rendimiento físico. Estas mejoras estuvieron acompañadas de una disminución del βA (1-42) hipocampal en los ratones 2xTg. El daño oxidativo cerebral y sistémico, LRP1 y BDNF hipocampal se mostraron disminuidos en los 2xTg mientras que el ejercicio no afectó. Sin embargo, el consumo de glucosa cerebral fue superior en los ratones transgénicos y la defensa antioxidante cerebral, mediada por la CAT, incrementó en los ratones 2xTg tras el entrenamiento. Nuestro cuarto modelo experimental incluyó un modelo triple transgénico (3xTg) para la enfermedad de Alzheimer y ratones no transgénicos como control. Además, dividimos a los animales en el grupo ovariectomizado y en el grupo con cirugía simulada. Tratamos a los animales con ejercicio voluntario durante 12 semanas cuando tenían 6 meses de edad (grupos ejercicio) y mantuvimos sedentarios a los grupos controles. Finalmente utilizamos ocho grupos experimentales que incluían el modelo de Alzheimer y/o el climaterio artificial y/o el tratamiento con ejercicio. Sacrificamos a los animales y analizamos diversos biomarcadores cerebrales entre los que se incluyeron los niveles de βA y tau hiperfosforilado, la vía amiloidogénica (C99/APP), los niveles de BDNF y su señalización a través de TrkB y CREB, PGC-1α y la expresión de las enzimas antioxidantes GPx, Mn-SOD and CAT. El entrenamiento físico implementado a los ratones 3xTg y la ovariectomía no afectaron a los niveles de βA ni a la fosforilación de tau cerebral. El ejercicio, sin embargo, previno parcialmente la vía amiloidogénica en todos los casos. Además, el entrenamiento incrementó los niveles de BDNF hipocampal en los 3xTg, ovariectomizados y sus controles. Encontramos un incremento en la activación de CREB en los ratones no transgénicos y 3xTg no ovariectomizados sometidos a ejercicio. Asimismo, la expresión de CAT hipocampal incrementó en los ratones 3xTg, entrenados y sedentarios, mientras que la ovariectomía los redujo. Esta disminución fue revertida mediante el ejercicio físico. Finalmente, en el quinto modelo experimental perseguimos evaluar el posible efecto sinérgico de 6 semanas de ejercicio físico y el mimético farmacológico de BDNF, 7,8-dihidroxiflavona (7,8-DHF), en ratas jóvenes sanas. Usamos cuatro grupos experimentales que incluyeron el grupo entrenado, el tratado con 7,8-DHF y el grupo sometido a la combinación de ejercicio y 7,8-DHF. Evaluamos la cognición de los animales a través del test de reconocimiento de objetos y el estado comportamental a través del test de campo abierto. El tratamiento con 7,8-dihidroxiflavona y/o ejercicio forzado no mostró un efecto sinérgico en los parámetros psicológicos analizados. El aprendizaje y la memoria no mejoraron, mientras que el comportamiento exploratorio incrementó con todos los tratamientos, aunque principalmente con el ejercicio físico. Teniendo en cuenta todos nuestros hallazgos podemos concluir que tanto el ejercicio agudo como el entrenamiento incrementan los niveles periféricos de BDNF en humanos mientras que el entrenamiento mejora los rasgos fisiopatológicos y funcionales de dos modelos diferentes de enfermedad de Alzheimer. Así, el ejercicio ejerce beneficios cerebrales a través de un amplio abanico de mecanismos fisiológicos que incluyen la modulación de BDNF.Physical activity prevents numerous disorders and improves many pathophysiological disease features. Exercise has been classically associated to muscular and metabolic benefits. However, the effects of exercise training on brain function, specialty known as “Neurobiology of exercise”, have recently received much attention. The beneficial effects of exercise have been clearly established in several pathologies such as Alzheimer´s disease, Parkinson´s disease, amyotrophic lateral sclerosis, schizophrenia, bipolar disorder and depressive disorder, among others. These findings have lead to use exercise training as a therapeutic coadjutant strategy not only in research but also in the clinical practice. According to a large amount of evidence, physical exercise not only restores the altered physiology of several neuropsychiatric diseases but also improves the brain function, cognition and psychological condition in healthy people. Exercise exerts its action on the brain through many molecular pathways and physiological mechanisms. Some of them include the prevention of oxidative damage, release of endorphins, restoration of dopamine signaling and those actions mediated by the neurotrophic factors. Neurotrophic factors are growth factors with different sources and pathways of action. Although there are several factors included in this family of proteins, we would like to highlight the insulin-like growth factor 1 (IGF-1), the vascular endothelial growth factor (VEGF), the brain-derived neurotrophic factor (BDNF), the nerve growth factor (NGF), and the neurotrophins 3 and 4/5 (NT-3 and NT-4/5 respectively). The main actions mediated by these factors include the hippocampal neurogenesis, neuron repair, axogenesis, dendrogenesis, synaptic transmission modulation, synaptogenesis, and thereby brain plasticity. The functional consequences of their modulation include long term potentiation, improvement of learning and memory, anxiolytic and antidepressant effects. BDNF is one of the most important neurotrophic factors since it mediates pleiotropic trophic effects in the brain. In addition, it is also one of the main neurotrophic factors induced by both chronic and acute exercise. High levels of BDNF have been found in brains of exercised persons, through post mortem studies and jugular blood in vivo analysis, as well as in trained animals. The brain modulation is produced mainly in the hippocampus and limbic system and thereby it has been associated with several cognitive and psychological improvements. There is yet no consensus about the adequate blood processing conditions to standardize peripheral BDNF assessment in exercise studies. Serum, plasma, whole blood, and platelets-rich plasma with several methodological processing conditions have been indistinctly used in the literature. This leads to inconsistencies in the studies. This Doctoral Thesis aims to clarify the effects of acute exercise and training in human blood levels of neurotrophic factors as well as the appropriate methodological protocol for the BDNF analysis. We also aim to determine the molecular pathways involved in the beneficial effects of exercise training in two mice models of Alzheimer´s disease. Finally, we aim to test the possible synergistic beneficial effect of exercise training and a BDNF pharmacologic mimetic on brain function in rats.In our first experimental model, healthy adolescents were divided into two groups according to their exercise habits. The trained group included members of an elite cyclist team, and thereby highly trained. The control group included sedentary matched controls. We compared the IGF-1 and BDNF blood levels of both groups in the pre-season and post-competition period. We evaluated the possible effect of the circulating BDNF on the cAMP response element-binding (CREB) activation in peripheral blood mononuclear cells. All participants were also evaluated through anthropometric, hematological and acelerometric analysis. We found that the BDNF and IGF-1 blood levels were increased in the trained adolescents compared with the sedentary controls when we analyzed it during the pre-season, characterized by a moderate physical demand. This increment did not affect to the CREB. Moreover, the differences between both groups disappeared when we compared the neurotrophic factor levels in the post-competition period, characterized by a maximum physical performance requirement. In our second experimental model we determined the effect of an acute bout of exercise on BDNF blood levels in healthy adults under different blood processing conditions in a time-course analysis (at baseline, immediately after exercise, at 30 and 60 minutes of recovery). The blood samples that we analyzed included serum coagulated 10 minutes and 24 hours; plasma with EDTA, with and without platelets; and whole blood. We found an increment in BDNF levels after the acute exercise in the serum coagulated during 24 hours and in whole blood samples. These changes were not evident when analyzed in the serum coagulated during 10 minutes, total plasma and platelet-free plasma samples. The interference of the anticoagulants used for the plasma and the irregular platelet activation in the serum coagulated during 10 minutes led to a high variability in the BDNF levels. We have also found that the processing temperature of the samples and the hemoconcentration are relevant factors to take into account in these studies. In our third experimental model we used non transgenic and double transgenic mice (2xTg) for Alzheimer´s disease. We divided the animals into two groups: sedentary and exercised. At 10 months of age, trained groups were subjected to 12 weeks of a training combination of forced and voluntary exercise. Different psychological and physical tests were performed to the animals. We also evaluated brain glucose uptake by positron emission tomography and biochemical markers related to amyloid-β (Aβ) (1-42) levels and its modulation through the low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1), BDNF pathway (tyrosine kinase type B (TrkB) levels and CREB levels and activation), oxidative damage (malondialdehyde, glutathione, protein carbonylation), antioxidant defense levels (superoxide dismutase dependent of copper/zinc and manganese (Cu/Zn-SOD and Mn-SOD), glutathione peroxidase (GPx) and catalase (CAT)), and mitochondrial content (cytochrome-C) and biogenesis (peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1α, PGC-1α). The exercise training improved the behavior of the 2xTg mice as well as their physical performance. These improvements were accompanied by a hippocampal Aβ (1-42) reduction in the 2xTg mice. The cerebral and systemic oxidative damage, LRP1 and hippocampal BDNF levels were reduced in the 2xTg mice and the exercise did not affect it. Nevertheless, the brain glucose uptake was higher in the transgenic mice and the antioxidant defense, determined by the CAT, increased in the 2xTg mice after exercise. Our forth experimental model included a triple transgenic mouse model (3xTg) of Alzheimer´s disease and non transgenic mice as control. We studied the protective effect of exercise in ovariectomized mice. The exercise protocol included 12 weeks of spontaneous wheel-running. The animals were divided into eight experimental groups which included an Alzheimer´s disease model and/or artificial climacteric and/or exercise treatment. We sacrificed animals and analyzed several brain biomarkers which included the Aβ and hiperphosphorylated tau levels, the amyloidogenic pathway (C99/APP), BDNF levels and its pathway through TrkB and CREB, PGC-1α, and the expression the antioxidant enzymes GPx, Mn-SOD and CAT. The exercise training performed by the 3xTg mice and the ovariectomy did not affect to the brain Aβ and the tau hyperphosphorylated levels. Nevertheless, the exercise partially prevented activation of the amyloidogenic pathway in all cases. In addition, training incremented the hippocampal BDNF levels of the 3xTg, ovariectomized and sham. We obtained a CREB activation increment in the non transgenic and 3xTg non ovariectomized mice subjected to exercise. Moreover, the hippocampal expression of CAT increased in the 3xTg mice, trained and sedentary, whereas the ovariectomy reduced it. This was reverted through physical exercise. Finally, in the fifth experimental model we aimed to evaluate the possible synergic effects of 6 weeks of exercise training and a pharmacological BDNF mimetic, 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF), in healthy young rats. Thus, we used four experimental groups which included the trained group, the group with 7,8-DHF, the group subjected to a combination of exercise and 7,8-DHF and a control group. We evaluated the cognition of the animals thought the object recognition test and their behavioral condition by the open field test. The treatment with 7,8-DHF and/or forced exercise training did not show a synergic effect on the psychological parameters analyzed. The learning and memory did not improve, whereas the exploratory behavior incremented with all treatments but especially with the exercise training. Taking together our findings we can conclude that acute and chronic exercise increases BDNF peripheral levels in humans whereas exercise training improves the pathophysiological and functional features of Alzheimer´s disease in two different transgenic models. Exercise seems to contribute to brain benefits by a wide range of physiological mechanisms including the BDNF pathway