Evolutionary genomics and functional studies on the metabolic role of Blattabacterium, primary endosymbiont of cockroaches

Introducció La simbiosi, entesa com la relació de interdependència entre dos o més individus de diferents espècies, ha tingut un profunda influència al llarg de l’evolució de la vida. De fet, hi ha un ampli consens respecte a la importància de les associacions simbiòtiques, en l’aparició i evolució primerenca de la cèl•lula eucariota, així com en l’evolució del sistema immunitari en eucariotes complexos o en l’adquisició de noves capacitats metabòliques en plantes i animals, permetent-los així explorar noves fonts d’aliments o ocupar nous nínxols ecològics. Segons l’efecte de la interacció sobre els membres de l’associació, es poden distingir tres tipus: comensalisme, quan un dels membres es beneficia sense afectar l’aptitud de l’altre (o altres); parasitisme, quan un dels participants treu un avantatge disminuint l’aptitud de l’altre; i finalment mutualisme, quan ambdós socis es beneficien de la interacció. A més, també es poden classificar segons la localització del simbiont respecte de l’hoste entre endosimbionts (el simbiont habita a l’interior de cèl•lules de l’hoste) i ectosimbionts (quan el simbiont viu sobre la superfície de l’hospedador). Finalment, segons el grau de dependència, trobarem simbionts facultatius o obligats. S’han catalogat un gran nombre d’associacions simbiòtiques, de tot tipus, repartides per tot l’arbre de la vida. Aquesta gran diversitat d’interaccions és un clar indicador de la importància de les interaccions simbiòtiques per a l’evolució de la vida. Un dels casos més estudiats és la simbiosi d’insectes amb un ample espectre de bacteris. La presència en molts insectes de bacteris intracel•lulars mutualistes, coneguts com endosimbionts, pot ser una de les claus per explicar l’enorme èxit evolutiu d’aquest grup d’animals. En general tots els insectes tenen unes necessitats nutricionals molt paregudes. No obstant mostren una gran diversitat respecte a la dieta que segueixen. Molts insectes depenen d’una única font d’aliment, que en molts casos és deficient per a certs nutrients. Aquestes deficiències nutricionals de la dieta són compensades per les capacitats metabòliques de l’endosimbiont. Així, els pugons obtenen els aminoàcids essencials del seu bacteri endosimbiont, Buchnera aphidicola, ja que la saba de la que s’alimenten, si bé és rica en sucre és molt pobra en aminoàcids. D’una forma similar, insectes hematòfags com la mosca tse-tse o els polls dels cabells, obtenen vitamines del grup B a través de bacteris endosimbiotics. D’aquesta forma, l’establiment d’aquestes interaccions hauria permès als insectes explotar noves fonts d’aliment que d’altra forma serien insuficients per cobrir les seues necessitats nutricionals. No obstant, no tots els insectes que posseeixen bacteris endosimbionts depenen d’una única font d’aliment, per exemple, formigues o panderoles tot i ser generalistes també posseeixen bacteris endosimbionts de caràcter mutualista. La seqüenciació dels genomes de Blochmannia spp. i Blattabacterium sp., endosimbionts de formigues del gènere Camponotus i de panderoles respectivament, ha confirmat la contribució d’aquests bacteris al metabolisme del nitrogen dels seus hostes així com en la síntesi d’aminoàcids essencials. Segons el grau de dependència i l’edat de l’associació, es poden distingir dos tipus de simbionts. Per una banda, tenim els endosimbionts primaris (P-endosymbionts), transmesos de forma estrictament vertical i localitzats a l’interior de cèl•lules especialitzades de l’hoste anomenades bacteriòcits. Aquestes associacions són molt antigues i les relacions de dependència són tan fortes que cap dels dos membres del consorci podria sobreviure sense l’altre. Molts dels endosimbionts que complementen la dieta de l’hoste són d’aquest tipus, com l’abans esmentada B. aphidicola als pugons, Wigglesworthia glossinidia a les mosques tse-tse, Riesia pediculicula als polls o Carsonella rudii als psil•lids. Per altra banda, hi ha els endosimbionts secundaris (S-endosymbionts), que al contrari que els primers, no són indispensables per la supervivència de l’hoste, així que no estan universalment distribuïts. Al igual que els endosimbionts primaris, el seu mode de transmissió és vertical encara que s’han descrit casos de transferència horitzontal. A diferència dels endosimbionts primaris, els secundaris no estan necessàriament confinats a un únic teixit o a l’interior del citoplasma de cèl•lules especialitzades de l’hoste, podent-se trobar a l’hemolimfa, glàndules o altres teixits no especialitzats. Lluny d’ésser simples comensals, la presència d’aquest simbionts exerceix efectes tant positius com negatius sobre l’aptitud dels hostes. Així, alguns secundaris protegeixen els hostes front a l’estrès tèrmic (Serratia symbiotica als pugons), confereixen resistència front a l’atac de vespes parasitoides (Hamiltonella defensa als pugons també) o infeccions fúngiques (Regiella insecticola). Altres, en canvi, manipulen la sexualitat de l’hoste en benefici propi amb Wolbachia spp. es un exemple paradigmàtic ja que s’ha estimat que vora un 40% de les espècies d’artròpodes poden ser infectades per aquest gènere de bacteris. Finalment, hi ha casos on un sol bacteri no és capaç de satisfer les necessitats nutricionals dels seus hostes, i n’és necessari un segon, que complemente les capacitats metabòliques del primer. En aquest cas els simbionts es coneixen com co-primaris. Aquest tipus d’associació es troba al pugó del cedre (Cinara cedri). Buchnera BCc ha perdut la major part de gens necessaris per sintetitzar triptòfan, així els passos absents a Buchnera són duts a terme per Serratia symbiotica, que en aquesta espècie de pugó ha assolit el paper de simbiont co-primari. Durant la transició de vida lliure a intracel•lular, es donen de sèrie de canvis que modifiquen molt l’estructura genòmica d’aquests bacteris. Les característiques més destacades són la reducció genòmica i l’increment en contingut en AT. Dos factors són decisius per explicar el procés de reducció genòmica d’aquests bacteris. El primer és que al viure a l’interior d’una cèl•lula eucariota moltes funcions del bacteri esdevenen innecessàries o redundants. Així, la pèrdua dels gens que codifiquen per a les proteïnes encarregades d’aquestes funcions no tindria cap efecte en l’aptitud del bacteri, d’aquesta forma la pressió de la selecció natural sobre ells està relaxada. El segon factor es la dinàmica poblacional d’aquests bacteris. La transmissió vertical provoca continus colls d’ampolla reduint la mida efectiva de la població, incrementat així l’efecte de la deriva genètica. Els dos factors esmentats, faciliten l’acumulació de mutacions lleugerament deletèries a gens no essencials fins inactivar-los i posteriorment eliminar-los. El procés de reducció genòmica es dóna en dues fases ben diferenciades. Primer, just després l’establiment de la simbiosi, hi ha una proliferació de seqüències d’inserció (IS), afavorida per la relaxació de la selecció purificadora. L’increment d’IS afavoreix el procés de reducció genòmica i provoca reordenacions cromosòmiques mitjançant esdeveniments de recombinació homòloga. En una segona fase, les IS desapareixen i es dóna pas a un període d’estabilitat genòmica. No obstant, el procés de reducció genòmica continua a través de la pseudogeneització i eliminació individual de gens repartits per tot el genoma. La pèrdua dels sistemes de reparació del DNA durant el procés de reducció genètica així com la pressió mutacional de GC cap AT explicarien l’alt contingut en AT que tenen aquests genomes. La simbiosi entre Blattabacterium cuenoti i les panderoles és una de les associacions d’aquest tipus més antigues descrites. S’estima que ambdós espècies estan evolucionant juntes des de fa més de 140 milions d’anys, quan un Flavobacteri de vida lliure va infectar l’avantpassat comú de panderoles i tèrmits. Els bacteriòcits a l’interior dels quals viu Blattabacterium es localitzen al cos gras envoltats per un segon tipus cel•lular, els uricòcits, cèl•lules especialitzades dintre de les quals s’acumulen cristalls d’àcid úric. La major part de la informació sobre el paper de Blattabacterium al metabolisme del seu hoste ve de estudis clàssics basats en l’obtenció de panderoles aposimbiòtiques. D’aquesta forma es va poder relacionar Blattabacterium amb la síntesi de aminoàcids essencials. Altres estudis clàssics clarament relacionen la presència de Blattabacterium amb el metabolisme del nitrogen. Tot i ser amonotèliques, les panderoles tenen la capacitat de sintetitzar àcid úric, que en compte de ser eliminat és emmagatzemat als uricòcits en forma de sals d’urat. Aquests depòsits es veuen incrementats en individus aposimbiòtics. Paral•lelament, s’ha observat que a les panderoles que són alimentades amb una dieta rica en proteïnes, els dipòsits d’àcid úric s’incrementen notablement, així com el volum i nombre de uricòcits. No obstant, aquests dipòsits es redueixen ràpidament si seguidament les mateixes panderoles són alimentades amb una dieta pobra en proteïnes. Durant els últims anys, s’han seqüenciat els genomes de cinc soques de Blattabacterium, tres d’elles simbionts de panderoles omnívores: Blattella germànica (BBge), Periplaneta americana (BPam) i Blaberus gigantenus (BBgi), membres de les famílies Blattellidade, Blattidae i Blaberidae respectivament. A més, també hi ha disponible el genoma dels simbionts de la panderola Cryptocercus punctulatus (Cryptocercidae) (BCpu) i del tèrmit Mastotermes darwiniensis (Termitidae) (BMda), ambdós xilòfags i l’últim a més, l’únic membre de la família Termitidae que manté l’endosimbiont. Els genomes d’ aquests bacteris presenten les mateixes característiques que la resta d’endosimbionts: genomes reduïts (de 590 a 640 kb); baix contingut en GC (del 23.8 al 28.2%); manteniment de l’ordre gènic i una elevada taxa de substitucions nucleotídiques. Les soques simbionts de panderoles omnívores tenen la capacitat de sintetitzar tots els aminoàcids essencials. Per contra, tant BCpu com BMda han perdut l’habilitat de sintetitzar set d’aquests aminoàcids. En aquestes dos últimes soques, s’ha postulat que es la microbiota intestinal l’encarregada de proveir els aminoàcids essencials als hostes. Finalment, totes les soques de Blattabacterium tenen gens que codifiquen per a l’enzim ureasa. A més, les soques de BBge, BPam i BBgi posseeixen els gens codificants per a tots els enzims del cicle de la urea, mentre que a BCpu i BMda s’ha perdut el gen argH, que codifica per a la argininosuccinat liasa, interrompent d’aquesta forma el cicle de la urea. La presència d’ureasa ha permès postular un model que explica tant l’amonotelisme, com el reciclatge del nitrogen de l’àcid úric emmagatzemat als uricòcits. La ureasa degradaria urea formant amoníac i CO2. L’amoníac generat deurà ésser incorporat al metabolisme per l’acció de l’enzim glutamina sintetasa. Ara bé, per a que el model funcione cal inferir la presència tant de la glutamina sintetasa i dels enzims encarregats de degradar l’àcid úric (urat oxidasa, allantoinasa i allantoicasa) a l’hoste, ja que no estan codificats a Blattabacterium. L’ anàlisi de balanç de fluxos (FBA) realitzat sobre la xarxa metabòlica dels simbionts de B. germanica i P. americana assenyala que Blattabacterium té el potencial per a generar amoníac, quan s’optimitza la xarxa per a la producció de biomassa. S’ha proposat un model on es suggereix que el nitrogen excedent és emmagatzemat als uricòcits presents al cos gras en forma d’urat. En períodes de carència, aquests dipòsits seran mobilitzats per l’acció dels enzims urat oxidasa, allantoinasa i allantoicasa, que degradaran l’àcid úric a urea. Aquesta serà hidrolitzada a CO2 i amoníac per l’acció de la ureasa codificada a Blattabacterium. Finalment, l’amoníac alliberat per l’endosimbiont o bé serà incorporat al metabolisme del insecte gràcies a l’acció de la glutamina sintetasa de l’hoste, o bé serà excretat. Material i mètodes Seqüenciació, anotació i genòmica comparada amb les diferents soques de Blattabacterium Les mostres de cos gras obtingudes de femelles adultes de B. orientalis van ser enriquides amb Blattabacterium a través de diversos passos de centrifugació i filtració. Seguidament, abans de lisar les cèl•lules de l’endosimbiont, la mostra va ser tractada amb DNasa I, per eliminar el DNA de l’hoste però no el de Blattabacterium, ja que aquest últim està protegit per la membrana bacteriana. Finalment el DNA genòmic de Blattabacterium es va obtenir utilitzant el mètode del CTAB (bromur de cetiltrimetilamoni). Una volta purificat el DNA, es va quantificar mitjançant espectrofotometria. La seqüenciació es va fer mitjançant el sistema GS-FLX de Roche. Addicionalment, es van generar llibreries que es van seqüenciar per el mètode de Sanger. Les seqüències resultants del procés de piroseqüenciació van ser assemblades amb el programa Newbler. Després es va crear una base de dades compatible amb el programa GAP4, dintre del paquet Staden Package, per revisar l’assemblatge manualment. A aquestes base de dades van ser adjuntades les seqüències obtingudes pel mètode Sanger. Quan el genoma va ser tancat, es va començar el procés d’anotació. Les pautes de lectura oberta (ORF), es van identificar mitjançant el programa GLIMMER, encara que posteriorment van ser revisades manualment per identificar tant els codons d’inici com de parada, a més d’identificar possibles ORF obviades pel GLIMMER. L’assignació funcional d’aquestes ORF es va fer mitjançant la identificació d’ortòlegs a les altres soques de Blattabacterium i amb el Bacteroidete de vida lliure Flavobacterium psychrophilum mitjançant l’algorisme OrthoMCL. A més, es van fer cerques mitjançant BLASTP contra la base de dades no redundant de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Finalment, també es van realitzar cerques mitjançant BLASTX i BLASTN a les regions intergèniques per tal d’identificar possibles pseudogens no identificats pel GLIMMER. A cada gen codificant per proteïnes (CDS) va ser assignat, sempre que fos possible, una o diverses categories COG (Cluster of Orthologous Genes), un número de KO (KEGG orthology) així com codis EC (Enzyme Comission number). Per la identificació dels gens de RNA es va fer una cerca mitjançant el algorisme INFERNAL contra una base de dades de seqüències i estructures de RNA. Davant la manca del gen dnaA o les caixes DnaA, l’origen de replicació es va determinar mitjançant la desviació en GC, utilitzant el programa OriginX. El contingut G+C per al total del genoma es va determinar mitjançant el programa GeeCee, dintre el paquet EMBOSS. En canvi per determinar el contingut G+C als diferents gens, així com a diferent posicions de codons es va utilitzar un script de Perl. Finalmentm, la representació gràfica de la comparativa genòmica entre les sis soques de Blattabacterium seqüenciades es van fer mitjançant el paquet de R genoPlotR. Per a realitzar l’estudi comparatiu entre les sis soques de Blattabacterium el primer pas va ser l’obtenció del pan-genoma. La representació gràfica del pan-genoma es va fer amb R, utilitzant el paquet Vennerable. Els valors per a cadascun dels subespais es van extreure a partir de la taula d’ortologia obtinguda amb OrthoMCL. Es van realitzar corbes de rarefacció per veure la cobertura del pan-genoma amb sis soques, mitjançant la funció speccaccum del paquet Vegan per R. Per veure si la distribució de les diferents categories COG a les sis soques era estadísticament diferent es va realitzar una proba de la χ2, utilitzant com a referència la distribució a BBge. Les diferents soques també es van agrupar segons les distribucions COG utilitzant la funció heatmap.2 del paquet gplots per a R. Els efectes de la pèrdua dels tres primers gens del cicle de Krebs, als endosimbionts de B. orientalis i P. americana, es van mesurar mitjançant anàlisis estoiquiomètriques amb el programa METATOOL. Per determinar les relacions filogenètiques de les diferents soques de Blattabacterium, es va utilitzar un concatenat de tots els alineaments obtinguts amb Mafft de les proteïnes presents a les sis soques de Blattabacterium, que a més, tingueren un ortòleg a F. psychrophilum. El millor model evolutiu es va estimar amb ProtTest, i l’arbre es va obtenir per màxima versemblança, amb 100 pseudorèpliques utilitzant el programa RAxML. Posteriorment, es van situar els esdeveniments de pèrdua gènica sobre la topologia resultant. Finalment es van realitzar dos tipus d’anàlisis evolutives, a partir d’aliniaments de nucleòtids obtinguts utilitzant aliniaments de proteïnes com a motlle. Primer es van calcular les taxes de substitució sinònima (dS) i no sinònima (dN), així con la ràtio entre ambdues (dN/dS), per tal de determinar el tipus de pressió evolutiva que està actuant sobre cada gen, utilitzant el programa YN00 dintre del PAML. Seguidament es va determinar, mitjançant un test de raó de versemblança (LRT), quins dels gens presents a totes les soques, estaven evolucionant sota el rellotge molecular. Per evitar el problema que la saturació de substitucions nucleotídiques pot suposar per aquest tipus d’anàlisi, es van eliminar les terceres posicions de cada codó així com els gens que tenien una taxa de substitució igual o superior a 2.5 substitucions per lloc. El LRT es va realitzar tal com ve determinat al programa Baseml utilitzant el model evolutiu seleccionat per a cada aliniament mitjançant jModelTest. Es va determinar el valor de versemblança sota dues suposicions, primer assumint rellotge molecular i l’altra deixant cada rama evolucionar a una taxa diferent. Tots aquells gens que no rebutjaren el rellotge molecular, i que a més tingueren un ortòleg a F. psychrophilum, es van utilitzar per a situar els temps de divergència dels diferent nodes de la filogènia de Blattabacterium, utilitzant com a calibrador el temps de la divergència entre les soques BBge/BBgi i la resta, determinat pel registre fòssil fa 140 milions d’anys. Anàlisi transcriptòmica i resposta al contingut en proteïna de la dieta Es va obtenir el cos gras i ovaris (tots dos teixits on Blattabacterium s’allotja) de femelles adultes, de 3 a 5 dies. Com a control es va utilitzar el teixit epitelial situat baix el pronot de nimfes a l’estadi 6 de desenvolupament. La extracció de l’RNA total per a cadascun dels teixits es va fer, en condicions lliures de RNases amb el kit GenEluteTM Mammalian Total RNA Miniprep Kit de Sigma-Aldrich. Prop de 10 µg de RNA de cadascun dels teixits es van enviar a la empresa GATC-Biotech, on es va sintetitzar el cDNA utilitzant el kit Smart cDNA Construction Kit de clontech. Donat que hi havia mostres de tres teixits diferents, es va adjuntar una seqüencia marcadora a cadascuna de les llibreries per tal de diferenciar-les en posteriors processos. Les mostres es van seqüenciar mitjançant piroseqüenciació al 454 de Roche, utilitzant la química Titanium. Com a resultat d’aquest procés vam rebre tres conjunts de dades, un per cada teixit, on prèviament s’havien eliminat les seqüències de baixa qualitat. Seguidament es van identificar i eliminar les seqüencies provinents de Blattabacterium, mitjançant un mapeig amb MEGABLAST contra una base de dades formada pel genoma de BBge. Finalment, l’assemblatge es va fer amb el MIRA 3.2 treballant amb el mode EST. Els contigs obtinguts de l’assemblatge es van anotar amb Blast2GO; aquest programa inicia el procés de anotació mitjançant cerques per BLASTX contra la base de dades no-redundant del NCBI, seguidament assigna termes de Gene Onthology (GO) i codis enzimàtics a cadascuna de les seqüències. A partir de les dades obtingudes de la assignació de números EC, Blast2GO ens ofereix la possibilitat de generar mapes de rutes metabòliques utilitzant els mapes de la base de dades KEGG. Aquest mapes van ser curats manualment amb l’ajuda de las base de dades MetaCyc per tancar buits a les diferents rutes. Finalment es va comparar la distribució de termes GO entre els transcriptomes mitjançant un test de Fischer de dos cues. Durant l’anàlisi del transcriptoma, es van identificar seqüències gèniques per a tots tres gens implicats en la síntesi i degradació de l’àcid úric a urea, (xantina deshidrogenasa, urat oxidase, allantoinasa i allantoicasa), així com per a la glutamina sintetasa. Per estudiar la resposta d’aquests gens a la quantitat de proteïna ingerida a la dieta, es van dissenyar tres preparats alimentaris per a les panderoles amb diferents continguts en proteïna: del 0, 5 i 50% respectivament. L’aliment per a gossos fou control (25%). Femelles just acabades de mudar a forma adulta foren separades de la població general i es van mantenir durant dos dies amb la dieta control. Al tercer dia es va substituir la dieta control per un dels preparats abans esmentats per dos dies més. Al quart dia d’ençà que van mudar a adultes, es van viviseccionar per obtenir el cos gras i els ovaris. Es va extreure l’RNA total d’ambdós teixits, i es va sintetitzar el cDNA utilitzant hexàmers al atzar. D’aquesta forma es sintetitza el cDNA a la vegada de teixits de l’hoste i del bacteri. L’expressió relativa dels gens involucrats en el metabolisme de l’àcid úric a B. germanica i ureasa a Blattabacterium, així com la glutamina sintetasa de l’hoste es va mesurar mitjançant PCR quantitativa. Com a control intern es van gastar els gens de l’actina i el factor d’elongació EF-TU segons el gen d’interès fos de l’eucariota o del simbiont, respectivament. L’anàlisi estadística es va fer amb el programa REST. Resultats Seqüenciació i anàlisi comparada de Blattabacterium endosimbiont de B. orientalis El genoma de Blattabacterium endosimbiont de B. orientalis, està composat per un cromosoma de 634.449 bp i un plasmidi de 3735 bp. En total s’han anotat 627 gens (set d’ells al pl