Mecanismos de regulación de la enzima ribonucleótido reductasa de Saccharomyces cerevisiae en respuesta a la deficiencia de hierro

Mecanismos de regulación de la enzima ribonucleótido reductasa de Saccharomyces cerevisiae en respuesta a la deficiencia de hierro. Mantener un balance adecuado en los niveles de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs), precursores necesarios para la síntesis del DNA, es fundamental para preservar la estabilidad genómica y la viabilidad celular tanto durante la proliferación celular como en respuesta a daños en el DNA. La enzima ribonucléotido reductasa (RNR), responsable de la conversión de ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos, es una de las dianas de regulación principales durante la síntesis de dNTPs, por lo que múltiples mecanismos controlan su actividad durante el progreso del ciclo celular y en respuesta a daños en el DNA. Las RNRs de clase Ia presentes en todas las células eucariotas son enzimas esenciales compuestas por una subunidad grande R1, en la que se encuentra el centro catalítico y los sitios de regulación alostérica, y una subunidad pequeña R2 en la que se sitúa un centro de oxo-dihierro y un radical tirosil esenciales para la actividad enzimática. Dado que la enzima RNR requiere de hierro como cofactor esencial para su función, en este trabajo se planteó utilizar la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la actividad RNR en respuesta a condiciones de deficiencia de hierro. En S. cerevisiae, la subunidad catalítica R1 se localiza en condiciones normales en el citoplasma, mientras que la mayor parte de la subunidad pequeña R2 formada por el heterodímero Rnr2-Rnr4 reside en el núcleo de la célula. Una proteína nuclear conocida como Wtm1, que interacciona con la subunidad R2, es la responsable de anclarla al núcleo. Durante la fase S del ciclo celular y en respuesta a daños en el DNA, la ruta de integridad del DNA formada por las quinasas Mec1-Rad53-Dun1 se activa y promueve la rotura de la interacción entre la subunidad R2 y Wtm1. Como consecuencia la subunidad R2 se relocaliza desde el núcleo hasta el citoplasma, donde se ensambla en un complejo RNR activo y permite la síntesis de dNTPs. En este trabajo hemos observado que en respuesta a la falta de hierro se produce la salida de la subunidad R2 del núcleo al citoplasma de una forma totalmente independiente de las quinasas Mec1 y Rad53, sugiriendo la existencia de un nuevo mecanismo de regulación de la actividad RNR en condiciones de deficiencia de hierro. Estudios previos han demostrado que la deficiencia de hierro induce la expresión de dos proteínas de unión a RNA denominadas Cth1 y Cth2. Estas proteínas desempeñan un papel clave en la remodelación del metabolismo dependiente de hierro mediante la unión y degradación selectiva de un gran número de mRNAs que codifican proteínas que contienen hierro o que participan en procesos dependientes de hierro. Una de las dianas principales de Cth1 y Cth2 es la respiración mitocondrial, que resulta reprimida en respuesta a la escasez de hierro. En este trabajo hemos podido demostrar que Cth1 y Cth2 controlan la localización subcelular de la subunidad R2 en condiciones de déficit de hierro mediante la degradación específica del mRNA WTM1. La consecuente bajada en los niveles de proteína Wtm1 permiten la relocalización de la subunidad R2 al citoplasma y la activación de la enzima RNR. Además, hemos descrito que, en condiciones de limitación de hierro, la quinasa Dun1 participa en la regulación de RNR. Por un lado, hemos observado que Dun1 promueve la relocalización al citoplasma de la subunidad pequeña R2, mecanismo que depende de su dominio quinasa, mientras que su domino FHA (del inglés, forkhead-associated) no es necesario. Por otro lado, nuestros resultados sugieren que cuando los niveles de hierro son bajos, Dun1 regula los niveles de proteína Sml1, inhibidor de la subunidad grande R1, a través de un mecanismo independiente de las quinasas Mec1 y Rad53. Análisis de la estructura de la proteína Dun1 muestran que tanto su dominio quinasa y como su dominio FHA se requieren para inducir la degradación de Sml1 en condiciones de escasez de hierro, mientras que el residuo T380, que es fosforilad pot la quinasa Rad53 en respuesta a daños en el DNA, no es necesario. Nuestros resultados indican que, en condiciones de deficiencia de hierro, el descenso de los niveles de Sml1 es mediado por el complejo de ubiquitín-ligasas Rad6-Urb2-Mub1 a través del proteasoma 26S y por la ruta vacuolar proteolítica. Estos resultados revelan un nuevo papel para la quinasa Dun1 en la degradación de Sml1 y en la relocalización de la subunidad pequeña R2 bajo condiciones de deficiencia de hierro. Así pues, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que, en respuesta a la falta de hierro, S. cerevisiae reorganiza el metabolismo celular priorizando procesos esenciales dependientes de hierro como la síntesis de dNTPs sobre vías metabólicas que consumen gran cantidad de hierro y que no esenciales para la levadura como la respiración mitocondrial.Regulatory mechanisms of the enzyme ribonucleotide reductase in Saccharomyces cerevisiae response to iron deficiency. Maintaining a proper balance in the levels of deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs), precursors required for DNA synthesis, is essential to maintain genomic stability and cell viability in both cell proliferation and during the response to DNA damage. The enzyme ribonucleotide reductase (RNR), responsible for the conversion of ribonucleotides to deoxyribonucleotides, one of the major targets of regulation during dNTPs synthesis, therefore multiple mechanisms control its activity during cell cycle progression and in response to damage in the DNA. The RNRs class Ia, present in all eukaryotic cells, are essential enzymes formed of a large subunit or R1, which is the catalytic center and allosteric regulation sites, and a small subunit or R2, which stands an oxo-diiron center and a tyrosyl radical, essential for enzymatic activity. Since RNR enzyme requires iron as an essential cofactor for their function, in this work we proposed to use the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model to study the molecular mechanisms that regulate RNR activity in response to iron deficiency conditions. In S. cerevisiae, in normal conditions R1 catalytic subunit is located in the cytoplasm, whereas most of the small subunit R2 heterodimer formed by Rnr2-Rnr4 resides in the nucleus of cells. A nuclear protein knows as Wtm1, which interacts with the R2 subunit is responsible for anchoring the small subunit in the nucleus. During S-phase of the cell cycle and in response to DNA damage, the DNA damage checkpoint formed by Rad53-Mec1- Dun1 kinases is activated and promotes the lack of interacction between R2 subunit and Wtm1. As a consecuence, R2 subunit is relocated from the nucleus to the cytoplasm, where it is assembled into a complex active RNR and allows the synthesis of dNTPs. In this study, we observed that in response to iron deficiency R2 subunit relocalizes from the nucleus to the cytoplasm in a Mec1-Rad53 independent mechanim, suggesting the existence of a new mechanism of regulation of RNR activity under conditions of iron deficiency. Previous studies have shown that iron deficiency induces the expression of two RNA binding proteins called Cth1 and Cth2. These proteins play a key role in the remodeling of dependent metabolism by binding and selective degradation of many mRNAs encoding proteins that contain iron or are involved in iron-dependent processes. One of the main targets of Cth1 and Cth2 is the mitochondrial respiration, which is repressed in response to iron deficiency. In this work we have demonstrated that Cth1 and Cth2 control the subcellular localization of the R2 subunit in iron deficiency conditions by specific mRNA degradation WTM1. The resulting drop in Wtm1 protein levels allow relocation of the R2 subunit into the cytoplasm and the activation of the enzyme RNR. Furthermore, we reported that, under conditions of iron restriction, Dun1 kinase participates in the regulation of RNR. On one hand, we have observed that Dun1 promotes relocation to the cytoplasm of the small subunit R2, a mechanism that depends on the kinase domain, while its forkhead-associated domain or FHA is not necessary. Furthermore, our results suggest that when iron levels are low, Dun1 regulates Sml1 protein levels, R1 large subunit inhibitor, through a mechanism independent of Mec1 and Rad53 kinases. Analysis of protein structure Dun1 show that both its kinase domain as their FHA domain are required to induce Sml1 degradation in iron deficiency conditions, while the residue T380, which is phosphorylated by Rad53 kinases in response to DNA damage, it is not necessary. Our results indicate that, under conditions of iron deficiency, lthe ow levels of Sml1 are mediated by the ubiquitin-ligase complex Rad6-Urb2-Mub1 through 26S proteasome and vacuolar proteolytic pathway. These results reveal a new role for the Dun1 kinase in the Sml1 degradation and small subunit R2 relocation under iron deficiency conditions. Thus, the results obtained in this study suggest that, in response to lack of iron, S. cerevisiae reorganizes the metabolism prioritizing iron-essential dependent processes such dNTPs synthesis over metabolic pathways that consume large amounts of iron and are not essential for yeast cells as mitochondrial respiration