Caracterización de NF-КB en cáncer de mama: posible factor pronóstico y predictivo

La activación del factor de transcripción NF-kB juega un papel importante en el proceso de la oncogénesis. El propósito del presente estudio fue determinar si NF-kB se encuentra activado en cáncer de mama e identificar la correlación de su actividad con las características clínico-patológicas del tumor. Además, se analizaron aquellos genes cuya expresión está regulada por NF-kB en tejido tumoral, tejido adyacente al tumor y tejido normal procedente de reducciones mamarias. Finalmente se estudio si NF-kB o alguno de sus genes diana podría tener un papel en el tratamiento del cáncer de mama. Para el estudio de la activación de NF-kB se utilizaron muestras de tejido congelado procedentes de cirugía que fueron incluidas en OCT (compuesto para la temperatura óptima de corte) y a las que se les realizó un análisis histopatológico para comprobar la calidad. De las 450 muestras que analizamos, seleccionamos 148 muestras de carcinoma mamario y 16 de tejido adyacente no tumoral. Se obtuvieron los extractos proteicos de todas ellas y la determinación de la activación de las cinco subunidades de NF-kB se realizó mediante ELISA y se validó mediante western blot. Para la determinación de la expresión génica utilizamos tejido parafinado. Se extrajo el ARN y se realizó la transcripción inversa. La calidad de la muestra se determinó mediante el kit comercial “RT2 RNA QC PCR array”. El perfil génico se realizó con “RT2 Profiler PCR Array Human NF-kB Signaling Targets”. La sensibilidad al tratamiento con el fármaco quimioterápico doxorubicina se realizó con las líneas celulares derivadas de carcinoma mamario MCF7, MDAMB231, MDAMB468, SKBR3 y BT474. La activación de NF-kB inducida por la doxorubicina se evaluó dichas líneas celulares, realizándose también la comparación de la expresión génica antes y después del tratamiento. Se observó que las subunidades de NF-kB p65, p50, p52 y relB se encuentran activadas de forma significativa en tejido tumoral frente a tejido no tumoral, siendo el valor-p ≤ 0,005 en todos los casos. Además, en carcinoma ductal invasivo la activación de relB estaba asociada al tamaño tumoral (p=0,004), la invasión de tejidos adyacentes (p=0,01) y afectación ganglionar (p= 0,003) mientras que el aumento de la activación de la subunidad p65 estaba asociado a invasión linfática (p=0,033). Asimismo los niveles de activación de p52 y c-rel fueron más altos en carcinoma ductal invasivo que en carcinoma ductal in situ con valores-p de 0,008 y p=0,019 respectivamente. Por otra parte, valores de activación altos para p52 y relB en tumores positivos para receptores de estrógenos estuvieron significativamente asociados a recidiva tras el tratamiento. Respecto al análisis de expresión de genes diana de NF-kB, encontramos diferencias significativas entre la expresión de tejido normal/adyacente y tumoral en los genes CXCL10, CXCL9, MMP9 y LTA cuya expresión fue mayor en tejido tumoral y MYC, EGFR y MAP2k6 cuya expresión disminuía. También observamos que la expresión de MMP9, CXCL9 y MYC en tejido adyacente al tumor estaba aumentada respecto a tejido normal. En líneas celulares observamos que el tratamiento con doxorubicina producía la activación de NF-kB y de la expresión de genes asociados a actividades quimocina y citocina, señalización intercelular y respuesta inflamatoria mientras que la expresión de genes relacionados con actividades anti-apoptóticas y transducción de señales estaba disminuída. Estos datos indican que NF-kB está constitutivamente activado en cáncer de mama y sugiere que la actividad de NF-kB está asociada con la progresión tumoral y la supervivencia libre de enfermedad. Por otro lado, algunos genes asociados a NF-kB con expresión diferente entre tejido tumoral y normal podrían actuar como dianas terapeuticas potenciales en cáncer de mama ya que su expresión se modifica tras el tratamiento con doxorubicina. Finalmente se sugiere que el microambiente tumoral podría tener un papel destacado en la progresión del cáncer y la resistencia a fármacos.Activation of transcription factor NF-kB has been shown to play a role in oncogenesis. The purpose of the study was to determine whether NF-kB is activated in breast tumour carcinoma tissues and to identify any correlation between its activity and the clinical-pathological features of tumours. Besides we analyse genes whose expression is regulated by NF-kB in tumoral tissue, adjacent tumoral tissue and normal breast tissue. Finally we studied if NF-KB or its target genes could have a role in the treatment of breast cancer. For the study of activation of NF-kB we used frozen breast tissues from surgery. For quality control the frozen tissues were included in optimal cutting temperature compound (OCT) and a histopathological analysis was performed. Of them, we select 148 human breast carcinoma tissues and 16 adjacent non-tumour tissues. Nuclear protein extracts were obtained and NF-kB activation was determined by ELISA analysis and data were validated by western blot. To determine gene expression we used paraffin-embedded breast cancer tissues. The RNA was extracted and reverse transcription performed. The quality of samples was determined with RT2 RNA QC PCR array. The RNA profile was identified with RT2 Profiler PCR Array Human NF-kB Signaling Targets. Sensibility to doxorubicin was tested in MCF7, MDAMB231, MDAMB468, SKBR3 and BT474 breast cancer-derived cell lines. Doxorubicin-induced NF-kB activation was assessed in cells lines and a comparison between gene expression before and after the treatment with doxorubicin was performed. NF-kB study showed that p65, p50, p52 and relB subunits activation was significantly higher in breast tumours than in normal adjacent tissues (p≤0.005 in all cases). In invasive ductal carcinoma (IDC) relB activation was related to tumor size (p=0.004), invasion of adjacent tissues (p=0.01) and lymph nodes invasion (p= 0.003) and p65 increased levels were associated with lymph nodes invasion (p=0.033). p52 and c-rel levels were higher in invasive ductal carcinoma (IDC) than in ductal carcinoma in situ (DCIS) with p=0.008 and p=0.019 respectively. Higher p52 and relB activation levels in oestrogen receptor-positive tumour tissues were significantly related to patients relapse. On the other hand we detect significant differences in the expression between normal/adjacent and tumoral tissues in genes CXCL10, CXCL9, MMP9 and LTA whose levels were higher in tumoral tissue and MYC, EGFR and MAP2k6 whose levels were lower. We also found that MYC, CXCL9 and MMP9 expression was higher in adjacent tissue than normal tissue, pointing the importance of microenvironment in cancer. In cell lines we found that doxorubicin treatment enhanced NF-kB activation and expression of genes related to chemokine and cytokine activities, cell-cell signalling and inflammatory response whereas gene expression associated with anti-apoptosis activity and signal transduction was decreased. These data indicate NF-kB is constitutively activated in human breast carcinoma tissues and suggest NF-kB activity is related to tumour progression and disease-free patient survival. On the other hand, some genes related to NF-KB with differential expression between tumor and normal tissue could be a potential target in breast cancer as its expression is modified by doxorubicin. Finally our data suggest microenvironment could have a role in cancer progression and drugs’ resistance