Implicación de los receptores TLR4 en el daño cerebral causado por el consumo de alcohol

Alcohol abuse can cause brain damage and in some cases, neurodegeneration, but the molecular mechanism remains unknown. The Central Nervous System (CNS) has been considered, until recently, to be immunologically privileged system (Galea et al., 2007), but it is it is now well accepted however that immune surveillance occurs in the normal CNS and that inflammatory responses can take place in the context of disease. Indeed, recent studies indicate that the brain is the organ that coordinates and regulates all factors involved in the innate immune response, and inflammation is considered to be a critical event for several CNS diseases, as neurodegenerative disorders (Wild et al., 2008). Likewise, the innate immune system response is also involved in the damage associated to numerous autoimmune disorders, and also participates in other diseases as cancer, diabetes and cardiovascular diseases (Dalgleish and O'Byrne, 2006; Tedgui and Mallat, 2006). The toll-like receptors (TLRs) are the receptors implicated in the innate immune response to infection or damage. Recent evidence, demonstrates that TLRs are expressed in the CNS and neuroinflammation induced by the TLR activation, participates in brain injury and neurodegenerative processes (Babcock et al., 2006; Chen et al., 2007). Indeed, elimination of the TLR4 receptors, by using TLR4-KO mice, prevents ischemia and brain damage (Cao et al., 2007). It is important to highlight that although the innate immune response can be beneficial for some pathogenic conditions (Rivest, 2003), an exacerbate activation in the Innate Immunity can lead to neurodegeneration (Campbell, 2004). Notably, previous studies have been demonstrated that chronic ethanol intake induces the activation of the signalling pathways associated to the IL-1RI/TLR4 immune response in rat brain and even can cause cell death in glial cells in culture (Valles et al., 2004). Other results further demonstrate that low/moderate ethanol concentrations, in absence of IL-1 or LPS, are capable to activate the IL-1RI/TLR4 signalling pathways in astrocytes (Blanco et al., 2005; Blanco et al., 2008) and even in cultured microglia and in mice peritoneal macrophages (Fernandez-Lizarbe et al., 2008). These results suggest that the activation of ethanol-induced TLR4 immune response could be critical factor in the neuroinflammation processes induced by ethanol (Blanco and Guerri, 2007). On the basis on the above studies, and considering the critical role of TLR4 in the neuroinflammation and brain damage (Okun et al., 2009), the main objective of the present work has been to establish whether TLR4 receptors play an in vivo role in the ethanol-induced neuroinflammation, brain damage and possible neurodegeneration and if other immune systems, as inflammasome, participate in the neuroinflammation caused by alcohol consumption. The inflammasome is a multiproteic cytosolic platform that allows to the proinflammatory caspases, specifically caspase-1 to cleavage the interleuquin-1 beta and interleuquin 18 precursors (pro-IL-1beta and pro-IL-18, respectively) to the active forms (IL-1 and IL-18), triggering an important inflammatory response. Although, the molecular mechanisms involved in the inflammasome activation and whether the immune response are protective or induced inflammation is still uncertain, we know that inflammasome recruitment and activation is considered crucial in the natural innate immune response mechanism. One of the best characterized inflammasome is the NLRP3 inflammasome or criopirin, since it is involved in many autoimmune diseases. The results of the this work demonstrate that in vivo chronic ethanol intake triggers the activation of the TLR4 signalling pathway(MAPK, NF-kB/p65) in mice brain, activates microglial and astroglial cells, increases cytokines and proinflammatory mediators levels, and induces caspase-3 activation that leads to neuronal death in the brain cortex from TLR4 mice. The deficiency in the TLR4 function (TLR4-KO mice) protects from neuroinflammation, reactive gliosis and neuronal death. We further show that the TLR4 co-receptors as CD14 and MD-2, participate in the ethanol-induced TLR4 activation, since the down-regulation of these proteins, by using siRNAs, abolishes ethanol-induced TLR4 response in astrocytes in culture. Our findings also reveal that NLRP3-inflammasome participates in the alcohol induced-neuroinflammation. Thus, we demonstrate that chronic ethanol administration induces the activation of the cytosolic complex NLRP3/Casp1 inflammasome in both cultured astrocytes, brain (cortex and hippocampus) of TLR4+/+ mice. However, NLRP3 activation is absent or weak in brain of TLR4-KO animals. Our results also indicate that TLR4 receptors potentiate the neuroinflammatory response of the NLRP3/Casp1 inflammasome complex. Moreover, we observe that chronic alcohol treatment induces a weak polymorfonucleated infiltration (e.g. leucocytes, neutrophils) and even macrophages, events that could contribute to the activation of TLR4+/+ and NLRP3-inflammasome. Also, we highlight the relationship of the TLR4 immune response activation and neuroinflammation with the demyelination processes observed in alcoholics with alcohol abuse. In fact, we demonstrate that chronic ethanol treatment in mice concomitantly with the TLR4 activation and neuroinflammation; we also observed a reduction in the different myelin protein levels, as well as myelin morphological alterations, such as structural changes in the myelin sheats, and an important reduction of the white matter, axonal degeneration and neuronal death. The elimination of the TLR4 function, not only protects from neuroinflammation processes, but also eliminates most of the myelin alterations and neuronal damage associated to alcohol abuse. Corroborating our results, neuroimaging and postmortem studies in alcoholics´brain have been observed brain atrophy and ventricular growth with an important white matter reduction in the brain. Finally, we demonstrate that neuroinflammation and neurodegeneration processes induced by chronic alcohol intake, can cause epigenetic changes related to histone acetilation. These changes correlate with long term cognitive and behavioural dysfunctions in ethanol-treated animals. In summary, although molecular mechanisms implicated in the alcohol-induced brain damage are complex, the innate immune system and TLR4 activation in the brain play a critical role in the neuroinflammation and brain damage induced by alcohol abuse. Our results indicate that TLR4 receptors can represent a novel therapeutic target for the pathologies associated with alcohol consumption, like alcoholic hepatophaty, cortical white matter reduction, brain damage and cognitive and behavioural disorders associated to alcohol abuse.El abuso de alcohol puede causar daño cerebral y en ciertos casos cursa con neurodegeneración, aunque los mecanismos moleculares de estos efectos se desconocen. El Sistema Nervioso Central (SNC) ha sido considerado, hasta muy recientemente, como un sistema inmunológicamente privilegiado (Galea et al., 2007). Sin embargo, estudios de los últimos años indican que el cerebro coordina y regula numerosos aspectos de la respuesta inmune innata, y que la inflamación representa un factor crítico y esencial para muchas enfermedades del SNC, como son las enfermedades neurodegenerativas (Wild et al., 2008). Igualmente, la respuesta del sistema inmune innato también desempeña un papel crucial en el daño causado por numerosas enfermedades autoinmunes, y colabora en otras enfermedades tales como el cáncer, diabetes y daños cardiovasculares (Dalgleish and O'Byrne, 2006; Tedgui and Mallat, 2006). Los receptores TLRs (toll-like receptors), son los que fundamentalmente participan en la respuesta innata inmune, y responden ante procesos patogénicos. Recientemente, se ha demostrado que los TLRs se expresan en el SNC y que la neuroinflamación asociada a la activación de los receptores TLRs, participa en muchos procesos neuropatológicos y neurodegenerativos (Babcock et al., 2006; Chen et al., 2007). Además, se ha demostrado que la eliminación de los receptores TLR4 en ratones TLR4-KO, previene la isquemia y el daño cerebral (Cao et al., 2007). Es importante señalar, que aunque un incremento transitorio de dicha respuesta inmune puede ser beneficiosa para paliar condiciones patogénicas (Rivest, 2003), una activación exacerbada de la inmunidad innata puede conllevar a procesos implicados en neurodegeneración (Campbell, 2004). Aunque los procesos neuropatológicos por los que el etanol induce daño en cerebro no están esclarecidos, estudios de nuestro laboratorio ya habían demostrado que la administración crónica de alcohol en la rata, activaba vías de señalización asociadas a la respuesta de los receptores IL-1RI y TLR4 y causaba muerte neural en células gliales en cultivo (Valles et al., 2004). Estos resultados sugerían que el etanol puede causar daño a través de neuroinflamación (Blanco and Guerri, 2007). Además, datos del mismo laboratorio indicaban que el etanol, a concentraciones con relevancia a nivel fisiológico, y en ausencia de los ligando IL-1 o LPS, era capaz de activar la vía de señalización IL-1RI/ TLR4 no sólo en astrocitos (Blanco et al., 2005; Blanco et al., 2008) sino también en microglía y macrófagos de ratón (Fernandez-Lizarbe et al., 2008), sugiriendo que la activación de la respuesta de TLR4 inducida por etanol, podría ser de importancia en mecanismos de neuroinflamación (Blanco and Guerri, 2007). En base a los anteriores resultados y considerando el papel crítico de los TLR4 en la neuroinflamación, daño cerebral y neurodegeneración (Okun et al., 2009), el principal objetivo de este trabajo ha sido establecer el papel potencial de la respuesta de TLR4/IL1RI inducida por el etanol, tanto en la activación astroglial, daño cerebral y neurodegeneración causada por el consumo de alcohol, así como evaluar si éste daño cerebral causado por el consumo de alcohol se asociaba con alteraciones cognitivas tras la retirada del alcohol y los posibles mecanismos epigenéticos involucrados en dichas alteraciones. Por tanto, el presente trabajo se ha abordado la hipótesis de que los receptores TLR4 poseen un papel crucial en la neuroinflamación, daño cerebral y posible neurodegeneración inducida por el consumo de alcohol y que el inflamasoma participa en el daño neural causado por el consumo de alcohol. El inflamasoma, es una plataforma multiprotéica citosólica que permite la activación de las caspasas proinflamatorias, específicamente de la caspasa-1 que procesa el precursor de la interleucina-1beta (pro-IL-1beta) a la forma activa (IL-1) así como a otros miembros de la misma familia como la IL-18, conduciendo a una poderosa respuesta inflamatoria. Desconocemos cómo se produce la activación de los inflamasomas y los mecanismos por los cuáles se logra la respuesta inmunoprotectora, sin embargo, sabemos que el ensamblaje y la activación del inflamasoma es un proceso esencial en los mecanismos naturales de defensa inmune. El inflamasoma más estudiado ha sido el NLRP3 (criopirina), ya que se producen mutaciones en el gen que codifica algunas proteínas que lo conforman, participando en ciertas patologías autoinmunes. Los resultados obtenidos demuestran que el consumo crónico de alcohol en ratones, causa una activación en la señalización del TLR4 (MAPK, NF-kB/p65), estimula la microglía y astroglía, aumenta los niveles de citoquinas y mediadores proinflamatorios e incluso activa la actividad de la caspasa-3, causando degeneración y muerte neuronal en corteza cerebral de ratones. La deficiencia de la función de los receptores TLR4 en ratones (TLR4-KO) protege de la neuroinflamación y de gran parte de los efectos deletéreos que causa el consumo de alcohol en cerebro. Además, demostramos que los co-receptores del TLR4, CD14 y MD-2, participan en la activación del TLR4 por el etanol, ya que el silenciamiento de estos co-receptores, mediante el uso de siRNAs, bloquea la respuesta del TLR4 inducida por el etanol en astrocitos. Los resultados también demuestran que el inflamasoma NLRP3 participa en la neuroinflamación causada por el consumo de alcohol. De hecho, la administración de alcohol en ratones activa el complejo citosólico del inflamasoma NLRP3/Casp1, en astrocitos en cultivo y en la corteza cerebral e hipocampo de ratones TLR4+/+. Dicha activación es muy leve en animales TLR4-KO. Los resultados indican que los TLR4 potencian la respuesta neuroinflamatoria del complejo NLRP3/Casp1, y que los TLR4 son necesarios pero no suficientes para que el alcohol produzca una activación completa de este complejo citosólico. Además, también observamos que el consumo crónico de alcohol, causa una leve infiltración celular de polimorfonucleados (leucocitos, neutrófilos, etc.) y macrófagos en cerebro, que se conoce como infiltrado inflamatorio en cerebro. Es interesante resaltar que la activación de los receptores TLR4 y neuroinflamación se asocia con procesos de desmielinización, que se observan en alcohólicos con un abuso de alcohol. De hecho, demostramos que la activación del TLR4 tras el consumo de alcohol, causa una reducción en los niveles de diferentes proteínas de mielina, alteraciones morfológicas, cambios estructurales de las fibras mielínicas, notable reducción en la materia blanca, degeneración axonal y muerte neuronal asociada. La eliminación de la función de los TLR4, no sólo protege de gran parte de la neuroinflamación, sino que también de las alteraciones en la mielina y el daño neuronal asociado con el abuso de alcohol. En correlación con nuestros estudios, mediante técnicas de neuroimagen y en necropsias de cerebros de individuos alcohólicos, se ha observado una atrofia cerebral y agrandamiento ventricular, junto con una reducción del volumen de la sustancia blanca hemisférica cerebral. Finalmente, demostramos que la neuroinflamación y la neurodegeneración que induce el consumo crónico de alcohol, causa cambios epigenéticos en la acetilación de histonas y estos cambios, se correlacionan con alteraciones cognitivas y conductuales a largo plazo tras el consumo de alcohol. En resumen, aunque los mecanismos por los que el alcohol causa daño cerebral son complejos, la activación del sistema innato inmune y de los receptores TLR4 en el cerebro, desempeña un papel crucial en la neuroinflamación y en el daño cerebral que conlleva el abuso de alcohol. Por tanto, los receptores TLR4 pueden representar una nueva diana terapéutica para paliar o tratar ciertas patologías asociadas al consumo de alcohol, como la hepatopatía, la reducción en la materia blanca, el daño cerebral y las alteraciones cognitivas y conductuales asociadas con el abuso de alcohol