Mecanismo de depleción de glutatión y papel de la serín/treonín fosfatasa PP2A en la pancreatitis aguda.

RESUMEN En la presente Tesis Doctoral se han estudiado los mecanismos implicados en la degradación de glutatión reducido (GSH) en los modelos in vivo de pancreatitis aguda (PA) necrótica inducida por infusión retrógrada de taurocolato sódico al 3,5% y de PA edematosa inducida por una dosis supramáxima de ceruleína. Se ha confirmado que en la PA necrótica se produce la depleción mantenida de GSH. El mecanismo de síntesis de la glutamato citeína ligasa (GCL), mediado por ERK 1/2 y el factor de transcripción C-MYC, aparece activado tanto en la PA edematosa como en la necrótica, sin embargo en la necrótica se produce un fallo del mecanismo originado por la activación de la ribonucleasa (RNasa) pancreática en el citosol de las células acinares responsable de la degradación del ARNm de la GCL. Además se ha profundizado en el mecanismo implicado en la degradación de GSH en las etapas tempranas de la PA, caracterizando la tasa de degradación de GSH y de formación de glutamato y cisteína en extractos citosólicos de páncreas de rata con PA necrótica. La degradación de GSH y la formación de cisteína y glutamato son prevenidas en presencia del inhibidor de serín peptidasas amino etil bencenil sulfonil fluoruro (AEBSF). También se ha realizado cromatografía de afinidad con columnas de retención de GSH (1) y de AEBSF-biotinilado (2) en extractos citosólicos de áncreas de ratas con PA necrótica identificando proteínas GSH transferasas (1) y Glutarredoxina (1) o Htra 3ª (2), RNasa pancreática (2), Tripsina (2), ARID 4D (Rbpl 1) (2) y Arginina: glicina amidino transferasa (2) como posibles enzimas implicadas en la degradación de GSH. Por otro lado, se han descartado la Tripsina, gamma-Glutamil transpeptidasa y Carboxipeptidasa B pancreática como posibles responsables de la hidrólisis del GSH. En cuanto a la cascada inflamatoria, se ha determinado que durante la PA se produce la disminución de las serín treonín fosfatasas PP2A, PP2B (calcineurina) y PP2C, 1 hora después de la inducción de la PA necrótica y de las tirosín fosfatasas citosólicas que podría favorecer el aumento de la fosforilación de las MAPK en la PA. En estudios in vitro, se ha estudiado la actividad de la PP2A en células AR42J incubadas con taurocolato al 0,3%. El taurocolato produce una disminución transitoria de la actividad PP2A indicando la implicación de la misma en fenómenos de señalización celular. Además la PTX es capaz de prevenir esa perdida de la actividad PP2A mediado por el AMPc. Por inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) se ha comprobado que durante la PA se produce el reclutamiento de acetiltransferasas a los promotores de genes inflamatorios como egr-1, Inos-2, Icam-1 y TNF-alpha y que la PTX es capaz de bloquear la unión de las acetiltransferasas CBP y PCAF a dichos promotores. Además en algunos casosla PTX también promueve la unión del complejo deacetilasa mSIN3A/HDCA 1 a los promotores. __________________________________________________________________________________________________It has been studied the mechanisms involved in the degradation of GSH in vivo, using the model of necrotic acute pancretitis (AP) induced by infusion of sodium taurocholate (3,5%) and the model of aedematous AP induced by a supramaximal dose of caerulein, confirming that sustained depletion of GSH favours the development of necrotic AP. Despite the induction of glutamate citeine ligase (GCL) synthesis, mediated by ERK 1/2/C-MYC pathway in both models, in the necrotic AP the mechanism fails due to the activation of the ribonuclease (RNase) in the cytosol of pancreatic cells, which could be responsible for the mRNA degradation of the GCL. Furthermore, it has been characterized the rates of GSH depletion and glutamate and cysteine formation in cytosolic extracts of rat pancreas and the inhibition of these rates by the serine peptidases inhibitor bencenil amino ethyl sulfonyl fluoride (AEBSF) in the model of necrotic AP. It has also been carried out affinity chromatography for purification of GSH (1) and AEBSF-biotinylated (2) binding proteins from pancreatic cytosol of rats with necrotic AP, identifying proteins such as GSH transferases Glutaredoxin (1) or Htra 3A, pancreatic RNase, trypsin, ARID 4D and arginine: glycine Amidine transferase (2). Trypsin, Gamma-Glutamyl transpeptidase and pancreatic Carboxipeptide B, has been discarded as potential direct effector of the GSH depletion. As for the inflammatory cascade, it has been found the loss of activity of the serine threonine phosphatases PP2A, calcineurin and PP2C and of cytosolic tyrosine phosphatases during AP, wihch could favour the increased phosphorylation of the MAPK in the AP. In vitro, it has been studied the activity of PP2A in AR42J cells incubated with taurocholate 0.3%, which produced a transient decrease in the activity indicating the involvement of PP2A in cellular signaling events. Furthermore, the PTX is able to prevent the loss of PP2A activity mediated by cAMP. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) it has been also demonstrated the recruitment of acetyltransferase to the promoters of inflammatory genes such as egr-1, inos-2 and tnf-alpha during AP and its prevention by PTX treatment, which in some cases also promoted the mSIN3A/HDCA-1 deacetylase complex binding to their promoters