Desarrollo de marcadores moleculares de aplicación en genómica y programas de mejora de cítricos

Los cítricos son las especies frutales más importantes a escala mundial, siendo actualmente España el cuarto país productor. Esto contrasta con la escasez de estudios genéticos para su mejora, lo cual es debido a que presentan varios problemas, entre ellos su compleja biología reproductiva. Muchas especies de cítricos son apomícticas y sus semillas producen embriones nucelares que limitan el desarrollo de embriones zigóticos y por tanto, la construcción de familias segregantes. En los programas de mejora de cítricos y en los viveros es muy importante distinguir entre individuos zigóticos y nucelares para poder eliminar los genotipos no deseados. Normalmente, los isoenzimas se han empleado para determinar el origen genético de las plantas jóvenes. En el primer trabajo se propone el uso de marcadores microsatélites como una metodología alternativa y los comparamos con los isoenzimáticos para la distinción de plántulas zigóticas. Con objeto de facilitar el análisis de microsatélites se desarrolló también un protocolo rápido de extracción de ADN y un método de alta resolución y fácil revelado sin utilizar fluorocromos ni radioisótopos. Se emplearon dos familias segregantes: una derivada de un cruce interespecífico entre Poncirus trifoliata (L.) Raf. Var. Flying Dragon y el tangor Ortanique (Citrus reticulata (Blanco) x Citrus sinensis (L.) Osb.), familia PxO, la otra familia analizada fue obtenida por autofecundación de Fortunella crasifolia Swing., familia Fc. En el cribado de las plántulas PxO únicamente fue necesaria la utilización de un marcador microsatélite, ya que con éste se pueden distinguir los 4 alelos presentes en la población. En esta misma familia se analizaron otros microsatélites al igual que varios isoenzimas, y con todos se obtuvieron los mismos resultados, el 87% de los individuos de la familia son zigóticos. En familias obtenidas por cruzamiento entre especies muy distantes filogenéticamente, cualquier marcador codominante suele ser útil, sin embargo, cuando los parentales están genéticamente más relacionados, es más difícil encontrar variabilidad en cada locus. Por esto, la eficiencia de los microsatélites aumenta respecto a la de isoenzimas, debido a que presentan mayor grado de polimorfismos. Un caso extremo es la familia Fc, que esta formada por 106 individuos y fue generada por autofecundación. Se analizaron 5 microsatélites y 5 isoenzimas, y se encontraron 6 individuos zigóticos empleando los microsatélites, mientras que con los isoenzimas sólo se pudieron detectar 3 de los 6 observados con los microsatélites. Por tanto, la conclusión de este trabajo es que el empleo de microsatélites presenta mayor eficiencia que el de marcadores isoenzimáticos para identificar plántulas de origen sexual en los cítricos o, en general, plantas de origen desconocido. Una vez comprobada la gran utilidad que tienen los microsatélites en la mejora genética por su nivel de polimorfismo, rapidez, sencillez y gran repetibilidad que poseen, nos planteamos la obtención de nuevos microsatélites de cítricos. Con este objetivo se emplearon dos estrategias: la construcción de una genoteca de ADN genómico de P. trifoliata con fragmentos de pequeño tamaño, y la estrategia bioinformática consistente en cribar microsatélites empleando el programa FINDPATTERNS en todas las secuencias de cítricos incluidas en GenBank, en las cuales se buscaron todas las posibles repeticiones de di-, tri-, tetra- y pentanucleótidos. En total se obtuvieron 33 nuevos microsatélites, 6 en el cribado de la genoteca y el resto a partir de las secuencias de la base de datos. Estos nuevos marcadores se emplearon para la realización de mapas genéticos en tres familias segregantes: - Autofecundación de Poncirus trifoliata (var. Flying Dragon) - Citrus aurantium x Poncirus trifoliata (var. Flying Dragon) - Citrus volkameriana x Poncirus trifoliata (var. Rubidoux) Se construyó un mapa para cada uno de los parentales de cada familia, que poseen entre 48 y 120 marcadores, dependiendo de la heterozigosis de cada parental. El análisis comparativo entre genomas fue posible gracias al uso de los marcadores SSR principalmente, observándose varias reorganizaciones entre las distintas especies, así como entre las dos variedades de Poncirus trifoliata. Se observó que el orden de los marcadores en el mapa puede variar al bajar el LOD. Puesto que para futuros análisis genéticos lo más importante es que la ordenación sea la correcta, se prefirió construir los mapas a LOD alto a costa de dejar marcadores fuera de los grupos de ligamiento. Para la realización de los mapas de ligamiento también se usaron otros tipos de marcadores como los IRAPs, que aunque son menos informativos porque no son codominates, producen gran número de polimorfismos muy repetitivos con pocas combinaciones de cebadores y su distribución en el genoma es, en general, aleatoria. El análisis de segregación a nivel genómico puso de manifiesto la distorsión en la segregación en ciertas zonas concretas, que corresponderían a problemas gaméticos y/o zigóticos, es decir, presencia de factores letales. Una vez obtenidos los nuevos marcadores SSRs e IRAPs en cítricos, y sabiendo su localización genómica, nos propusimos utilizarlos para investigar sobre el origen de la variación molecular en el grupo de los mandarinos clementinos, debido a su importancia económica y por tratarse de un reto, ya que es una especie que se propaga vegetativamente, por lo que la variabilidad genética es muy limitada. En general, las nuevas variedades son detectadas por los propios citricultores mediante la identificación de mutaciones somáticas que afectan caracteres agronómicos, tales como la época de recolección. Se emplearon distintos tipos de marcadores con objeto de comparar su nivel de polimorfismo en una colección de 24 variedades. No se observó ningún polimorfismo al emplear SSR, por lo que la recombinación somática no debe ser una fuente importante de variabilidad en esta especie. Cuando se emplearon ISSRs, RAPDs y AFLPs, sólo un 2.4% de las combinaciones de cebadores produjeron polimorfismos, en comparación con los generados al emplear IRAPs (14.6%). Además, el diagrama evolutivo basado en estos últimos polimorfismos se ajusta bastante bien al origen conocido de algunas variedades. Por tanto, se concluye que los cambios en el ADN de los retrotransposones y las zonas adyacentes son más frecuentes que en el resto del ADN estudiado. Esto sugiere que los factores que provoquen la actividad de retrotransposones, como condiciones bióticas o abióticas de estrés, pueden ser una fuente importante de variabilidad genética a utilizar en programas de mejora de especies de propagación vegetativa, donde abunden los elementos de este tipo, como es el caso de los naranjos navel o los mandarinos clementinos. ------------------------------------------------------------------------------------------------------SUMARY Citrus are one of the major fruit crops in the world. Citrus represents a very wide set of species, but with long juvenile periods, a high level of apomixis and, generally high heterozygosity. This means that genetic studies on citrus are very costly, long and, therefore, scarce. In citrus breeding and genetics, it is very important to distinguish between zygotic and nucellar seedlings in order to eliminate unwanted genotypes. Usually, isozyme markers have been employed to determine the genetic origin of young plants. We propose the use of SSR markers as an alternative methodology and compare them with isozymes in this kind of screenings. Constructing genetic linkage maps would permit to compare the organization of different genomes and an efficient and continuous use of plant genetic resources to enrich the gene diversity of breeding programs, supported by markers at the selection stages. Five genetic linkage maps were constructed for the parents of three progenies. The number of polymorphic markers assayed ranged from 48 to 120, according to the heterozygosity of each parent. Focused on genome comparison, most of the markers were newly generated SSRs. IRAPs based on 4 retrotransposon sequences isolated from Citrus spp were also used to saturate the maps. Genomic reorganisations were observed when comparing the colinearity between Citrus and Poncirus, and also between P. trifoliata varieties. Clementines, due to their high quality, are one of the most important cultivated citrus mandarins. Genetic variability within this species is minimal when analysed by molecular markers, since the existing varieties have not been obtained through hybridisation, but through the selection of spontaneous mutations affecting traits of agronomic interest. Different kinds of markers based on primers of random sequence, simple sequence repeats and retrotransposon sequences that may reveal point mutations, somatic recombination and transposon activity, respectively, were used to compare the level of variability among 24 clementine varieties. Their ISSR, RAPD and AFLP analysis provided only two polymorphic bands. No variability was found by SSRs. The amplification of sequences adjacent to retrotransposons (IRAPs) yielded a higher number of polymorphisms (14.6 % versus 2.4 % for the previous mentioned marker types)