Caracterización fisiológica y molecular de cepas vínicas Saccharomyces sp. Influencia en su comportamiento durante la vinificación.

RESUMEN La transformación del mosto de uva en vino es un proceso microbiológico complejo aunque la fermentación alcohólica es llevada a cabo generalmente por cepas de Saccharomyces. El uso de inóculos de cepas preseleccionadas es frecuente en bodega dado que la cepa iniciadora se impone sobre las indígenas proporcionando ventajas encaminadas a una mayor producción y a una mejora de la calidad. El empleo de cultivos iniciadores hace necesario el establecimiento de criterios de selección de cepas con características deseables para su uso industrial. Además, el conocimiento en profundidad de la biología de estas levaduras permite el diseño de estrategias de mejora genética encaminadas a una mejora del proceso y/o de la calidad. C1. Caracterización fisiológica de cepas de Saccharomyces sp.: Estudio de la relación entre comportamiento fermentativo y resistencia a estrés. Se estudió el comportamiento fermentativo de diferentes cepas vínicas y se determinó su sensibilidad a diferentes condiciones de estrés demostrándose que existe una correlación estadísticamente significativa entre la capacidad de consumo de azúcares en condiciones de vinificación y la sensibilidad a dos condiciones de estrés, el oxidativo y el causado por adición de etanol. Los ensayos de resistencia a estrés pueden ser utilizados como criterios de selección de cepas con buen poder de fermentación. C2. Expresión de genes de respuesta a estrés durante la vinificación. Se analizó el perfil de expresión de genes de respuesta a estrés en diferentes condiciones de vinificación y en cepas con diferente comportamiento fermentativo. En cuanto a condiciones se ha visto que al inicio de la vinificación existe una influencia del pH del mosto y de la temperatura de incubación en la expresión de los genes analizados. En cuanto a expresión diferencial entre cepas se ha observado que las cepas con problemas fermentativos leves muestran en algunas fases de la vinificación y en algunos de los genes analizados niveles de expresión inferiores al resto de las cepas. En las cepas con problemas fermentativos graves el perfil de expresión es muy particular en varios de los genes mostrando algunos de ellos niveles máximos y mantenidos. A la vista de los resultados la correcta expresión de genes de respuesta a estrés parece importante para una adecuada adaptación de las levaduras a las condiciones de vinificación. C3. Expresión global en cepas con diferente comportamiento fermentativo durante la entrada en fase de crecimiento estacionaria. Se comparó la expresión génica (mediante micromatrices de DNA) y proteica (mediante electroforesis bidimensional) de una cepa con buen comportamiento fermentativo y otra cepa con leves problemas de vinificación. Así, se han podido determinar algunos factores moleculares que podrían explicar las diferencias fisiológicas entre estas dos cepas como aspectos relacionados con metabolismo de carbohidratos, con oxidación de compuestos orgánicos, con metabolismo del ergosterol y con respuesta a estrés. Además, se han observado diferencias de expresión de otros genes y proteínas que pueden ser relevantes para el uso industrial de estas levaduras. C4. Aplicaciones biotecnológicas. Se ensayó el comportamiento de las cepas en mostos naturales y partiendo de levadura seca activa demostrándose un comportamiento muy similar al que se había observado en vinificaciones con mosto sintético y con levaduras procedentes de cultivos líquidos. En segundo lugar se contruyeron cepas auxótrofas para uracilo de manera que se pueda estudiar el efecto de manipulaciones genéticas. Así, se puede ensayar la sobreexpresión de genes que mejoren la capacidad fermentativa en la cepa incapaz de completar el proceso de manera que no es necesario recurrir a condiciones limitantes de vinificación. __________________________________________________________________________________________________Must grape transformation into wine is a complex microbiological process although the alcoholic fermentation is mainly carried out by Saccharomyces strains. The use of preselected wine yeasts commercially available as active dry yeast is frequent since the initiator strain prevails on the natives providing advantages directed to a greater production and quality improvement. The use of this methodology makes necessary the establishment of criteria of wine yeast selection with desirable characteristics for its industrial use. In addition, a depth knowledge of the biology of these yeasts allows the design of genetic manipulation directed to an improvement of the process and/or a better quality of the final product. In this PHD project different wine yeast were characterized in order to obtain strains with different capabilities to conduct the vinification process. The resistance of these strains to different stress conditions was tested and we found a statistically significant correlation between the fermentative behaviour and the resistance to stress conditions. Later on we studied the molecular response of some of these yeasts analysing gene expression (RT-PCR quantitative and semi quantitative, micro arrays, macro arrays) and protein profiles (two-dimensional electrophoresis). With these studies it has been possible to determine some molecular factors that could explain the physiological differences between the strains like aspects related to carbohydrate metabolism, oxidation of organic compounds, metabolism of ergosterol and stress response. In addition, differences in the expression of other genes and proteins could be relevant for the industrial use of these strains. Finally, we tested the fermentative behaviour of these strains in conditions that try to mimic those which are found in the winery (natural must, active dry yeast) obtaining similar results to the previous experiments (synthetic must, liquid culture). Moreover we introduced an autotrophy in one of the strains with fermentative problems so it is possible to study the overexpression of genes which can improve the fermentative behaviour in non-limiting conditions