Recherche du biocolloïde Cryptosporidium parvum dans les matrices environnementales : évaluation des techniques de purification et de dénombrement automatisé

Les travaux de recherche concernant Cryptosporidium parvum sont variés et tentent d'apporter chacun leur réponse au problème de santé publique que constitue ce parasite. Selon notre approche, trois grands axes de recherche peuvent être établis : le premier consiste en l'évaluation du niveau de contamination par la détection et la quantification des oocystes dans des milieux divers ; le second axe concerne l'ensemble des recherches vouées à la rupture du cycle parasitaire, enfin le troisième axe moins développé car plus récent s'attache à la prédiction des risques par les techniques de modélisation. Nos travaux s'inscrivent dans le premier axe et ont pour objectif principal de mettre en évidence une méthode de purification des oocystes contenus dans les échantillons environnementaux qui serait compatible avec l'emploi de méthodes de dénombrements automatisés. Outre la contrainte de limite de détection directement liée au rendement de la méthode de purification, la perspective d'utilisation d'une méthode de dénombrement automatisé implique que les suspensions purifiées destinées à être dénombrées soient peu chargées en particules. Ainsi, en plus de l'intérêt porté aux rendements respectifs des méthodes de purification, une attention particulière a également été portée aux capacités des méthodes à éliminer les particules environnementales des suspensions purifiées. La technique de référence que représente la flottation sur solution de Percoll/saccharose a été comparée à six autres procédures de flottation ou de gradient de densité. Les rendements de récupération et la turbidité des suspensions purifiées obtenues dans des eaux de surface, dans des eaux usées, dans des boues de stations d'épuration ont servi de base à la comparaison de ces techniques. Nous avons cherché à augmenter les rendements de purification par une action visant à diminuer l'adsorption des oocystes aux particules environnementales. Les propriétés d'adsorption des oocystes étant directement liées à leurs propriétés de surface, dans une première étape nous avons caractérisé la charge de surface et le potentiel hydrophobe de la paroi d'oocystes aux caractéristiques proches de celles des oocystes environnementaux (oocystes préservés de l'action des agents dénaturants classiquement utilisés dans les procédures de purification). Par ailleurs, à des fins de comparaison avec les résultats d'autres études, l'action du bichromate de potassium sur les propriétés de surface des oocystes (puissant oxydant couramment utilisé pour la conservation des suspensions de selles contaminées) a également été évaluée. Dans un second temps, l'optimisation des rendements nous a amené à évaluer les impacts d'un agent dispersant (pyrophosphate de sodium), d'un tensio-actif anionique (SDS) et d'un tensio-actif non ionique (Tween 80). Enfin, l'étude portant sur les techniques de purification a été conclue par la détermination de deux fenêtres potentielles de tri en cytométrie en flux, l'une basée uniquement sur les caractéristiques morphologiques des oocystes, l'autre sur la taille et l'intensité de fluorescence. La proposition de l'utilisation conjointe de ces deux fenêtres pour réaliser le tri des oocystes dans des suspensions environnementales partiellement purifiées est une alternative aux autres méthodes de tri en cytométrie. Par ailleurs, le développement et la validation d'une méthode de dénombrement, basée sur un immunomarquage en suspension des oocystes de Cryptosporidium parvum, ont d'abord été réalisés. Cette technique d'immunofluorescence a permis de tester le dénombrement automatisé des oocystes par un système d'analyse d'images (IDRA) progressivement développé au cours de l'étude. L'optimisation du système IDRA a notamment été réalisée grâce à des matrices environnementales. D'un point de vue fondamental, nos travaux ont montré que le bichromate de potassium n'altère pas la charge de surface des oocystes mais qu'il augmente le caractère hydrophobe de la paroi des oocystes. Des oocystes comparables à ceux trouvés dans l'environnement ont une charge de surface fortement négative et une paroi au caractère hydrophobe peu prononcé. D'un point de vue pratique, nos travaux ont conduit à l'élaboration de nouveaux protocoles de purification des oocystes de Cryptosporidium dans les eaux de surface, les eaux usées et les boues primaires de station d'épuration..ont conduit à mettre en place les bases d'un procédé de tri des oocystes par cylométrie en flux basé sur l'utilisation simultanée d'une fenêtre de tri axée sur la morphologie des oocystes et d'une autre basée sur leur immunomarquage. Ils ont également conduit à la validation d'une méthode d'immunomarquage en suspension des oocysles plus efficace que les méthodes de marquage classiquement préconisées. Enfin, à partir de ce procédé de marquage, un système d'analyse d'images destiné au dénombrement automatisé des oocystes a été développé et évalué en collaboration avec une société spécialisée. Sous réserve de modifications, le système développé présente le potentiel nécessaire pour dénombrer efficacement des oocystes marqués y compris pour des montages chargés en particules comme des suspensions purifiées d'eaux usées.Non disponible/Not availabl