Potential of Ectomycorrhizal Fungi as drivers of plant establishment on soils contaminated with fluorinated organic compounds

Ectomycorrhizal (ECM) fungi can play an important role on forest ecosystems. It is crucial to understand and explore the capacity of ECM fungi to improve plant development and successful establishment on disturbed soils. The main objective of the work described in this thesis was to explore the potential of ECM fungi found to persist in a disturbed area to tolerate and/or degrade fluorinated organic compounds, and also to assess the tolerance and symbiotic efficiency of ECM fungi - Pine on contaminated soils. The diversity and persistence of ECM fungi in a Pinus pinaster plantation established with plants inoculated at the nursery with selected ECM fungi and with non-inoculated plants was investigated. Nursery inoculated plants promoted plant growth in the field, with different ECM communities found to be present on the inoculated and non-inoculated plants. The inoculated fungi Laccaria sp., Rhizopogon sp., Suillus bovinus, and Pisolithus sp. persisted on the inoculated plants after 2 and 5 years of field establishment. Laccaria sp., Rhizopogon sp., and Pisolithus sp. were also detected within the non-inoculated trees but, with the exception of Pisolithus sp., the fungi did not correspond to the same fungal species detected on the inoculated plants. The results reinforced the benefits of using nursery inoculated plants on forest reclamation processes. The potential of P. tinctorius, a widespread fungus on forest and found to persist in plants after field establishment in disturbed areas, to tolerate and/or degrade organic pollutants was further assessed. P. tinctorius was able to tolerate and degrade 2- and 3-Fluorophenol (FP) at different extents in glucose supplemented liquid medium. 3-Fluorocatechol (FC) and 4-FC were detected as degradation metabolites. Metabolic intermediates compatible with fluoromuconates were identified, indicating that cleavage of the aromatic ring occurred. To our knowledge, this is the first time the degradation of mono-FP by an ECM fungus is reported. P. tinctorius was also capable to tolerate and degrade trifluoroacetate, at different extents, in solid and liquid medium supplemented with glucose. Defluorination was not found and a volatile compound with a mass similar to fluoroform was detected from cultures of the fungus. However, further confirmation of this compound is still needed. The results evidence the role ECM fungi play in the degradation of fluorinated organic compounds, enhancing their potential contribution to rhizoremediation technology. The effect of benfluralin, a persistent herbicide, on the development of P. pinea seedlings and colonisation by P. tinctorius and S. bellinii was performed. Benfluralin had an inhibitory effect on plant growth and ECM colonisation. Inoculation with P. tinctorius promoted plant development and nutrient uptake in benfluralin spiked soil, suggesting that the fungus may have conferred seedlings protection against benfluralin toxicity. The same was not observed on the seedlings inoculated with S. bellinii. Therefore, the use of P. tinctorius - P. pinea symbiosis could enhance plant establishment in pesticide contaminated soils. Furthermore, how benfluralin affected P. pinea seedlings previously mycorrhized with P. tinctorius and S. bellinii was also assessed. Mycorrhized P. pinea seedlings revealed higher plant growth in the presence of benfluralin, although the herbicide affected ECM colonisation and nutrient uptake, even after establishing the symbiosis. Fungal role on plant antioxidant response in the absence and presence of benfluralin was also evaluated. Inoculation with S. bellinii led to higher lipid peroxidation in the presence and absence of benfluralin, suggesting that this increase could be related to the fungus symbiosis and not to benfluralin. In plants inoculated with P. tinctorius, lipid peroxidation and H2O2 decreased, indicating that the fungus conferred root protection against benfluralin. Superoxide dismutase and catalase activity increased on noninoculated seedlings exposed to benfluralin, but the same was not observed in the inoculated seedlings. Therefore, the antioxidant response to abiotic stress depends of the plant-fungus species, and of the level of stress. The results corroborated the findings from the previous study, demonstrating that P. tinctorius-P. pinea association represents a possibility for increasing plant’s protection and growth when exposed to contaminated soils. Overall, P. tinctorius revealed to be capable to tolerate and degrade fluorinated organic compounds, as well as to potentiate plant growth on contaminated soils. As such, P. tinctorius could confer plants with an important advantage as a reconversion strategy for soils contaminated with organic pollutants.Os fungos ectomicorrízicos (ECM) desempenham um papel importante nos ecossistemas florestais. Desta forma, é importante compreender e explorar a capacidade destes fungos no estabelecimento e desenvolvimento de plantas em solos contaminados. O trabalho descrito nesta tese teve como principal objetivo explorar o potencial dos fungos ECM, que persistiram em locais sob stress, de tolerar e/ou degradar compostos fluorados orgânicos, assim como avaliar a tolerância e eficiência simbiótica de fungos ECM com plantas em solos contaminados. A diversidade e persistência de fungos ECM numa plantação de Pinus pinaster, estabelecida numa zona de solo queimado, com plantas inoculadas em viveiro com fungos ECM selecionados e plantas não-inoculadas foram investigadas. A inoculação com os fungos ECM promoveu o crescimento das plantas no campo, existindo diferenças ao nível das comunidades de fungos ECM nas plantas inoculadas e não inoculadas após 2 e 5 anos da plantação. Os fungos inoculados em viveiro Laccaria sp., Rhizopogon sp., Suillus bovinus, e Pisolithus sp. persistiram nas plantas inoculadas. Laccaria sp., Rhizopogon sp., e Pisolithus sp. também foram detetados nas plantas não-inoculadas, contudo estes fungos não correspondem às mesmas espécies encontradas nas plantas inoculadas, com a exceção de Pisolithus sp.. Estes resultados reforçam os benefícios do uso de plantas inoculadas com fungos ECM em viveiro na recuperação de áreas florestais. O fungo P. tinctorius, que se encontra muito frequentemente nas florestas, persistiu nas plantas inoculadas no campo. O seu potencial para tolerar e/ou degradar mono – fluorofenois (FP) foi avaliado. P. tinctorius foi capaz de tolerar e degradar 2- e 3-FP em meio sólido e líquido suplementado com glucose. 3- Fluorocatechol (FC) e 4-FC foram detetados como intermediários da degradação. Outros compostos compatíveis com fluoromuconatos também foram identificados, sugerindo que o fungo foi capaz de quebrar o anel aromático, contudo a libertação de fluoretos não foi detetada. Esta é a primeira vez que a degradação de mono -FP por um fungo ECM é reportada. Este fungo, P. tinctorius, também foi capaz de tolerar e degradar trifluoroacetato em meio sólido e líquido suplementado com glucose. A liberação do ião fluoreto não foi detetada, tendo sido identificado um composto volátil com massa viiequivalente ao fluorofórmio. Os resultados evidenciam a capacidade dos fungos ECM para degradar compostos fluorados orgânicos. O efeito do herbicida benfluralina no desenvolvimento de plântulas de P. pinea e na colonização das raízes pelos fungos P. tinctorius e S. bellinii foi avaliado. O herbicida benfluralina teve um efeito inibitório no crescimento das plântulas assim como na colonização das raízes pelos fungos ECM. No entanto, a inoculação com o fungo P. tinctorius permitiu o crescimento das plântulas de P. pinea e a absorção de nutrientes em solos contaminados com o herbicida, mas o mesmo não foi observado na inoculação com S. bellinii. Os resultados demostram que o P. tinctorius conferiu proteção às plântulas de P. pinea contra a toxicidade da benfluralina, sugerindo que a associação P. tinctorius - P. pinea poderá ser vantajosa no crescimento de plantas em solos contaminados. O efeito da benfluralin em plântulas de P. pinea micorrizadas com os mesmos fungos também foi estudado. As plântulas micorrizadas apresentaram crescimento superior a plantas controlo na presença de benfluralina, embora o herbicida tenha afetado a colonização dos fungos e a absorção de nutrientes. O papel dos fungos ECM na resposta antioxidante da plântula na ausência e presença da benfluralina também foi avaliado. A inoculação com S. bellinii proporcionou uma maior peroxidação lipídica na planta na presença de benfluralina, enquanto a inoculação com P. tinctorius diminuiu os danos celulares, sugerindo que este fungo teve um papel protetor contra a benfluralina. A atividade das enzimas superóxido dismutase e catálase aumentou nas plântulas não-inoculados expostas à benfluralina, contudo o mesmo não foi evidenciado nas plântulas inoculadas, sugerindo que a resposta depende das espécies de fungos e do nível de stress aplicado. O presente estudo confirma que a associação P. tinctorius ¬ P. pinea pode aumentar a proteção e crescimento da planta em solos contaminados. Em geral, P. tinctorius foi capaz de tolerar e degradar compostos fluorados orgânicos, potenciando o crescimento e desenvolvimento de P. pinea em solos contaminados com benfluralin. Como tal, P. tinctorius poderá ser uma importante ferramenta na reconversão de solos contaminados com poluentes orgânicos