Nanotoxicology: study of nanomaterials’ genotoxic effects in cell lines

Dissertação de mestrado em Biologia (Biologia Humana e Ambiente), apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2015.Henriqueta Louro (orientadora externa), Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, I.P.; Deodália Dias (orientadora interna), Departamento de Biologia Animal da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa.Work developed in Laboratory of Genetic Toxicology of the Department of Genetics of the National Institute of Health Doutor Ricardo Jorge.[PT] Nos dias de hoje, surge cada vez mais a necessidade de se recorrer a uma maior qualidade e quantidade de variados produtos, para que seja possível responder ao rápido crescimento da população. Assim desenvolvem-se novas tecnologias, das quais, uma das mais recentes é a utilização de nanomateriais (NMs) em diversas áreas, como na cosmética, alimentação, biomedicina, indústria, entre outras, designando-se assim de NMs manufaturados (produzidos deliberadamente pelo Homem). Os NMs contêm propriedades distintas ao nível da estrutura levando a um aumento da área superficial relativamente ao volume e, consequentemente, a um aumento das moléculas na superfície, sendo que estas características modificam a reatividade, melhorando muitas das suas propriedades. Porém, os NMs têm suscitado grande interesse por parte dos investigadores, pois o seu efeito para a saúde humana ainda não é bem conhecido e alguns estudos sugerem a sua implicação no desenvolvimento de cancro. Apesar da grande variedade de estudos efetuados acerca da genotoxicidade dos NMs, os resultados obtidos acerca do perigo que estes podem constituir para o ser humano não são concordantes. Este facto deve-se às características que os NMs apresentam e à sua capacidade de as alterar, consoante os meios em que se encontram e das condições em que são utilizados como, por exemplo, o tamanho, estado de aglomeração/agregação, ligação a proteínas, presença de metais de transição entre outros. Assim a avaliação dos efeitos dos NMs levando em consideração as especificidades destes, tem surgido como uma nova área da toxicologia, a nanotoxicologia. Nesta área, verifica-se que existe na literatura acerca da toxicidade dos NMs falta de concordância, pelo que surge a necessidade de se efetuarem mais estudos recorrendo a metodologias padronizadas e a NMs bem caracterizados, de maneira a conseguir-se comparar resultados. O objetivo deste trabalho foi investigar a cito- e genotoxicidade de NMs, na perspetiva da nanotoxicologia, contribuindo para a avaliação da sua segurança. O estudo envolveu NMs desenvolvidos com o intuito de aplicação médica, o Poli(metil metacrilato) (PMMA) e um novo NM recentemente desenvolvido a partir desse, o Poli(metil metacrilato)-eudragit (PMMA-eud). Foram ainda investigados dois NMs manufaturados frequentemente utilizados na indústria, um NM de dióxido de titânio (TiO2) e outro de nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNTs). Os NMs analisados foram previamente caracterizados com detalhe relativamente às suas propriedades físico-químicas e as suspensões para a exposição das linhas celulares foram preparadas de acordo com metodologias padronizadas. Para avaliação da citotoxicidade, utilizaram-se os ensaios clonogénico e contagem de células, bem como a análise de índice replicativo. O efeito genotóxico foi avaliado através do ensaio do cometa e do ensaio do micronúcleo com bloqueio da citocinese, realizado de acordo com as orientações internacionais para testes de genotoxicidade. O efeito do PMMA e PMMA-eud foi avaliado em fibroblastos de ratinho (células L929) através do ensaio do micronúcleo em que foram determinados também os índices proliferativo e replicativo para avaliação da citotoxicidade. Na experiência preliminar, verificou-se um atraso ou um bloqueio do ciclo celular quando as células foram expostas por 48h a PMMA-eud, pelo que se optou por uma exposição de 54h no ensaio seguinte que não revelou efeitos citotóxicos nas células expostas a nenhum dos dois NMs. Quanto à genotoxicidade destes dois, somente os PMMA induziram um aumento na frequência dos micronúcleos 54h após exposição, mas apenas em duas concentrações, sem um efeito de dose-resposta. Estes resultados sugerem que a aplicação médica de PMMA-eud pode ser vantajosa em relação ao PMMA, uma vez que apresenta menos efeitos adversos. A diferença obtida entre estes dois NMs pode ser devida à carga de superfície, que é distinta entre os dois, ou ainda a uma maior capacidade do PMMA-eud para formar mais aglomerados, relativamente à PMMA, tornando estas últimas partículas mais pequenas, podendo facilitar a entrada dentro das células. Relativamente aos NMs manufaturados, TiO2 e MWCNTs utilizaram-se as células do epitélio pulmonar (A549) para a sua avaliação de toxicidade, uma vez que a via mais provável de exposição é a via respiratória. A citotoxicidade destes NMs foi avaliada através do ensaio clonogénico. Após 8 dias de exposição o TiO2 revelou-se ligeiramente citotóxico apenas numa concentração, enquanto os MWCNTs foram citotóxicos em todas as concentrações analisadas, sendo possível delinear uma curva de dose-resposta. No entanto, nos ensaios de citotoxicidade realizados após exposição de 24h ou de 48h (contagem de células e índices proliferativo e replicativo), não foram observados efeitos citotóxicos. Para a avaliação dos efeitos genotóxicos causados por estes NMs, foram avaliadas as quebras de ADN em cadeia simples e cadeia dupla após 24 horas de exposição, assim como as quebras cromossómicas durante uma exposição de 48 horas através dos ensaios do cometa e do micronúcleo respetivamente. Através do ensaio do cometa, observou-se um aumento nos danos no ADN das células expostas por 24h a TiO2, que era dependente da concentração. No entanto não se observou genotoxicidade no ensaio do micronúcleo após exposição por 48h a este NM. No que respeita ao TiO2, este NM de forma cristalina anatase, mostrou causar um aumento nos danos de ADN no ensaio do cometa. Este resultado, foi coerente com outros estudos efetuados anteriormente utilizando um outro TiO2 na forma anatase, sugerindo que esta propriedade físico-química, é importante para a genotoxicidade deste NM. Quanto aos MWCNTs, não se verificou nenhum efeito genotóxico nos dois ensaios efetuados. Os resultados negativos obtidos nos MWCNTs, podem dever-se à forte capacidade de aglomeração. Com este estudo, podemos concluir que a avaliação das propriedades físico-químicas dos NMs é um fator importante relativamente à avaliação dos efeitos tóxicos destes. Pequenas modificações de um NM podem condicionar o seu efeito adverso, pelo que são necessários mais estudos para compreender os mecanismos relevantes, permitindo no futuro desenvolver NMs sem efeitos negativos para a saúde humana. Por sua vez, é importante prosseguir estudos de genotoxicidade utilizando metodologias padronizadas a partir de NMs de referência para garantir a sua utilização segura.[EN] The nanomaterials (NMs) have distinct structural properties, namely their size and increased surface area/volume ratio, and these characteristics change their reactivity, improving the applications in biomedicine, cosmetic as well as in industry. However, these properties may also lead to different toxicological consequences, such as the development of cancer. This project aimed to contribute to the safety evaluation of NMs that are used or being developed for human applications, using nanotoxicology approaches. The study focused in Poly(methyl methacrylate) (PMMA) and poly(methyl methacrylate)-eudragit (PMMA-eud) NMs, used in the biomedical field for drug delivery, and titanium dioxide (TiO2) and multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs), that are frequently used in industry. Following the preparation of the dispersion of the NMs, previously characterized in detail, the cytotoxic effects of the NMs were analyzed in cell lines using clonogenic assay, cell counting assay, proliferation and replication indexes. The comet and the cytokinesis-blocked micronucleus assays were used to investigate genotoxicity. The effects of PMMA and PMMA-eud were evaluated in mouse fibroblasts (L929) and after 54 hours of exposure, no impact on cell cycle progression or cytotoxicity was observed for any of the NMs. PMMA revealed genotoxic effects while PMMA-eud was negative. Concerning TiO2 and MWCNTs, a pulmonary cell line (A549) was used. The clonogenic assay showed high cytotoxicity of MWCNTs while TiO2 had low cytotoxicity, 8 days after exposure. However, the cytotoxicity assays using 24 or 48 h exposure did not reveal any cytotoxicity of the NMs. TiO2 induced genotoxicity, with a dose-dependent increase in DNA damage detected by comet assay 24 h after exposure, while MWCNTs were negative. There was no increase in the micronucleus frequency after TiO2 or MWCNTs, showing the absence of clastogenic or aneugenic effects. The present study showed that the NMs physicochemical properties may determine their toxicological effects