Iron homeostasis in immune mononuclear cells: a potential role in atherogenesis

Tese de Doutoramento em Biologia (Especialidade Biologia Molecular) apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2015. Submetida a 30 de Outubro de 2014, defendida a 5 de Março de 2015, aprovada com Distinção e Louvor.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, (INSA, IP) Grupo de Imunologia Molecular e Celular (Novembro de 2009 a Março 2015); Equipa 34 do Institut de Chimie et Substances Naturelles (Novembro 2009 a Dezembro 2011); Equipa 13 do Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan (Setembro 2012 a Março 2015).[PT] A aterosclerose (AT) é uma doença inflamatória caracterizada pela formação de lesões designadas “placas ateroscleróticas” na parede de vasos sanguíneos. A formação destas lesões tem início na disfunção endotelial decorrente da ação de vários fatores de risco e que resulta na acumulação e modificação de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (nomeadamente LDL oxidado (oxLDL)). A acumulação subendotelial de oxLDL promove a ativação das células endoteliais e o consequente recrutamento de células imunitárias, incluindo monócitos e linfócitos do sangue periférico. Os monócitos infiltrados diferenciam-se em macrófagos que, por ingestão de oxLDL, acumulam lípidos no seu interior e se diferenciam nas chamadas “células esponjosas” (do inglês “foam cells”), que são características das placas ateroscleróticas. Vários autores observaram a acumulação de ferro em placas ateroscleróticas, frequentemente associada a “células esponjosas” derivadas de macrófagos. Em 1981, Sullivan propôs a chamada “hipótese do ferro” na qual o nível de ferro armazenado no organismo poderia constituir um fator de risco no desenvolvimento e progressão da AT. De acordo com esta hipótese, a reduzida frequência de desenvolvimento de AT em doentes com hemocromatose hereditária – caracterizados por macrófagos deficientes em ferro apesar da elevada sobrecarga de ferro sistémica – sugere que a retenção de ferro no macrófago promovida pela hepcidina (Hepc) poderá constituir um mecanismo pró-aterogénico crucial na possível associação do ferro à aterogénese. De facto, estudos recentes indicam que a Hepc pode desempenhar um papel pró-aterogénico e que a promoção da saída de ferro mediada pela ferroportina-1 (Fpn1) poderá constituir um mecanismo de resistência do macrófago à diferenciação em “células esponjosas”. Por outro lado, e apesar do seu potencial papel como ferroxidase envolvida na saída de ferro em macrófagos, a ceruloplasmina (Cp) é também capaz de oxidar outros substratos tais como as partículas de LDL. Adicionalmente, visto que a sua expressão é fortemente induzida em condições pró-inflamatórias, a Cp tem sido proposta como um potencial fator pró-aterogénico. Neste contexto, o principal objetivo do presente estudo foi clarificar a regulação da expressão de proteínas envolvidas no metabolismo do ferro nas células imunitárias que infiltram as placas ateroscleróticas, com particular interesse na proteína exportadora de ferro Fpn1 e na Cp como sua potencial parceira neste processo. Numa primeira fase, o objetivo do estudo foi caracterizar a expressão das duas isoformas da Cp em linfócitos, monócitos e macrófagos bem como avaliar o seu potencial envolvimento como ferroxidase na saída de ferro no macrófago mediada pela Fpn1. Os resultados obtidos demostraram que, para além da isoforma solúvel da Cp (sCp) já descrita em outros estudos, os linfócitos, monócitos e macrófagos expressam também uma isoforma membranar desta proteína. A diminuição da expressão da Cp membranar após o tratamento com PIPLC – uma enzima que corta especificamente proteínas com âncoras GPI – demonstrou que pelo menos parte da Cp associada à membrana corresponde à isoforma GPI-Cp nestas células. Adicionalmente, os resultados obtidos pelo nosso grupo de investigação permitiram concluir que a regulação da expressão da Cp em células imunitárias varia de acordo com o tipo de célula, com o seu estado de ativação e inclusivé com o tipo de isoforma. De facto, neste estudo observou-se que condições de stress oxidativo promoveram a diminuição do nível de mRNA de ambas as isoformas da Cp, ao passo que condições pró-inflamatórias induziram o aumento significativo e exclusivo do nível de mRNA da isoforma solúvel (sCp). A expressão da Cp nas células imunitárias que se encontram envolvidas na formação e desenvolvimento das placas ateroscleróticas (monócitos/macrófagos e linfócitos) pode constituir uma fonte de Cp na placa e, consequentemente, um mecanismo adicional para a oxidação de partículas de LDL em condições pró-inflamatórias, o que é corroborado pela co-localização da Cp e oxLDL anteriormente descrita em áreas pró-ateroscleróticas na parede do vaso. Efetivamente, a hipótese da Cp constituir um fator pró-aterogénico é apoiada por vários estudos que observaram uma associação entre o elevado nível de Cp sérica e o risco de desenvolvimento da AT. Contudo, a expressão da Cp em células imunitárias pode estar também associada ao efluxo de ferro nestas células. Estudos recentes demonstraram que após estimulação com ferro, a expressão de Fpn1 em macrófagos aumenta significativamente em macrófagos, sendo recrutada para a membrana plasmática, onde se encontra enriquecida em microdomínios denominados de “jangadas lipídicas” (do inglês “lipid rafts”). Neste estudo, o padrão pontilhado da distribuição da Cp observado à superfície celular de monócitos, macrófagos e hepatócitos imortalizados (HepG2) é indicativo de que esta proteína se encontra concentrada em domínios membranares. Os resultados obtidos confirmaram que parte da Cp expressa em macrófagos bem como em células HepG2 se encontra localizada nas “jangadas lipídicas” e demonstraram ainda uma co-localização parcial entre a GPI-Cp e a Fpn1 em macrófagos estimulados com uma elevada concentração de ferro, o que sugere que a Cp poderá participar como ferroxidase no efluxo de ferro mediado pela Fpn1. Contudo, dado o caráter parcial da co-localização da GPI-Cp e Fpn1, é possível que a sCp ou uma outra ferroxidase possam estar também envolvidas no transporte de ferro pela Fpn1 em macrófagos estimulados com sobrecarga de ferro. Um estudo recente sugere que a proteína precursora do péptido β-amilóide (APP) poderá estar envolvida no efluxo de ferro mediado pela Fpn1 em neurónios, o que é corroborado pela acumulação de ferro nestas células em ratinhos App-/-. Os resultados aqui apresentados confirmaram a expressão da APP em macrófagos e demonstraram que condições de elevada concentração de ferro promovem o aumento da expressão da APP bem como a sua co-localização com a Fpn1 nas “jangadas lipídicas”. Estes resultados estão de acordo com a hipótese de que a APP possa colaborar com a Fpn1 no efluxo de ferro em macrófagos estimulados com sobrecarga de ferro. Deste modo, é proposto um modelo no qual ambas as isoformas da Cp bem como a APP poderão estar envolvidas no efluxo de ferro mediado pela Fpn1 em macrófagos, podendo apresentar papéis sobrepostos mas também complementares. Numa segunda fase, propusemo-nos a clarificar o efeito da presença das partículas de oxLDL na expressão de algumas proteínas-chave no metabolismo do ferro em macrófagos. Os nossos resultados demonstraram que a estimulação de macrófagos com oxLDL levou à polarização do fenótipo Mox descrito por Kadl et al, bem como à acumulação intracelular de lípidos. A análise da expressão génica revelou que a exposição às partículas de oxLDL promoveu o aumento significativo da transcrição da heme oxigenase-1 (HO-1, gene Hmox1) e da Fpn1. Este aumento da transcrição de Hmox1 e Fpn1 não foi observado na presença de partículas de LDL nativo ou acetilado, o que sugere que este efeito é específico da modificação oxidativa das partículas de LDL. Tratamento de macrófagos Nrf2-/- e Nrf2+/+ com oxLDL mostrou que o aumento do nível de mRNA da Hmox1 e da Fpn1 induzido por oxLDL é mediado, pelo menos em parte, pelo fator de transcrição Nrf2. A exposição dos macrófagos a oxLDL conduziu ainda ao aumento significativo da transcrição da Hamp1 (gene da Hepc), interleucina-6 (IL-6, gene Il6) e da cadeia pesada da ferritina (H-Ft, gene Fth1), bem como a diminuição significativa da transcrição de ambas as isoformas da Cp. Contudo, e ao contrário do observado na HO-1, o aumento significativo do nível de mRNA da Fpn1 induzido por oxLDL não foi traduzido num aumento significativo a nível proteico. Este resultado sugere que a síntese da Fpn1 se encontra limitada no fenótipo Mox, provavelmente através de um mecanismo de regulação pós-transcricional influenciado pelo nível intracelular de ferro. Estes resultados sugerem ainda que, apesar da forte indução da transcrição da Fpn1, o efluxo de ferro nos macrófagos Mox se mantém provavelmente residual devido ao nível proteico basal da Fpn1. Contudo, como uma consequência a longo prazo da redução da transcrição da Cp e/ou do aumento da Il6 e Hamp1, é possível que o efluxo de ferro possa estar diminuído nos macrófagos Mox. Por outro lado, a estimulação simultânea de macrófagos com oxLDL (ativador do fenótipo Mox) e com lipopolissacarídeo combinado com interferão-γ (LPS/IFNγ, ativadores do fenótipo M1) induziram a diferenciação de um fenótipo misto entre Mox e M1 (Mox/M1), o que demonstrou que o fenótipo Mox não é predominante sobre o fenótipo M1 nestas condições. Os macrófagos Mox/M1 apresentaram acumulação intracelular de lípidos à semelhança dos macrófagos Mox, sendo caracterizados por um aumento significativo da transcrição da Hmox1, Il6, Fth1 e Cp (especificamente a isoforma sCp) e por uma diminuição significativa da transcrição da Fpn1 à semelhança dos macrófagos M1. Estes resultados sugerem que macrófagos expostos a um ambiente rico em oxLDL e em condições pró-inflamatórias como LPS/IFNγ promovem a acumulação intracelular de lípidos e de ferro em conjunto com o aumento da produção de sCp e de citocinas pró-inflamatórias tais como a IL-6, provavelmente contribuindo para a oxidação das partículas de LDL e para a inflamação local, o que poderá ter um papel pró-aterogénico. De acordo com estudos recentes, é o aumento de expressão de Fpn1 que desencadeia um mecanismo que conduz ao transporte reverso de colesterol e consequente resistência ao desenvolvimento de “células esponjosas”. Deste modo, podemos assumir que a expressão basal (Mox) ou diminuída de Fpn1 (M1, Mox/M1) não confere proteção contra a formação das “células esponjosas”, o que é apoiado pelos resultados de elevada acumulação intracelular de lípidos observada em macrófagos Mox e Mox/M1. Concluindo, os resultados apresentados neste estudo estão de acordo com a “hipótese do ferro” proposta por Sullivan e indicam potenciais mecanismos quer para a acumulação de ferro em macrófagos, quer para a oxidação de LDL, ambos favorecendo a diferenciação de “células esponjosas” nas placas ateroscleróticas, o que contribui para o desenvolvimento e instabilidade das lesões e consequentemente para a progressão da AT.[EN] Atherosclerosis is an inflammatory disease characterized by the formation of vessel wall plaques, initiated by oxidized LDL (oxLDL) accumulation and infiltration of immune cells. Iron accumulation in atherosclerotic plaques was proposed to constitute a risk factor in atherogenesis and immune cells could contribute to this risk. Herein, we studied the iron homeostasis of lymphocytes, monocytes and macrophages in a context of atherogenic conditions. Particularly, we investigated the expression and regulation of the iron exporter ferroportin-1 (Fpn1) and its potential functional partner ceruloplasmin (Cp). We demonstrated that lymphocytes, monocytes and macrophages express both a soluble Cp and a membrane GPI-Cp. Through oxidation of LDL, Cp expressed by immune cells could contribute to the reported association between high Cp levels and increased cardiovascular risk. We showed that GPI-Cp partially co-localizes with Fpn1 in lipid rafts of iron-treated macrophages and could participate in Fpn1-mediated iron export. However, we proposed that besides Cp, the β-amyloid precursor protein (APP) could be a functional partner of Fpn1 in macrophages that needs to be further studied. The effect of oxLDL on the iron homeostasis was investigated in macrophages. Despite oxLDL-driven Nrf2 activation and increased heme oxygenase-1 expression, Mox macrophages were not protected from foam cell formation like Mhem/M(Hb) macrophages, showing lipid accumulation, basal levels of Fpn1 at cell surface along with upregulation of interleukine-6 and hepcidin. Simultaneous exposure to oxLDL and LPS/IFNγ induced a Mox/M1 phenotype closer to M1 than Mox, with increased interleukine-6 and H-ferritin expression along with decreased Fpn1 expression. Our results suggest that macrophages exposed to a microenvironment rich in oxLDL and pro-inflammatory cytokines are prone to accumulate both lipids and iron while secreting high levels of pro-inflammatory cytokines and Cp, which will further promote the local inflammation and LDL oxidation. In summary, our results support the “iron hypothesis” in atherogenesis proposed by Sullivan.Bolsa de Doutoramento financiada por FCT (SFRH/BD/48671/2008)