Base genética da hipercolesterolemia familiar

Tese de Doutoramento em Bioquímica (Genética Molecular) apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2014. Defendida e aprovada em 4 de novembro de 2014.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis do INSA, IP, Grupo de Investigação Cardiovascular (jan 2008 a nov 2014).Mafalda Bourbon, investigadora do INSA, IP.[PT] A Hipercolesterolemia Familiar (FH) é uma doença autossómica dominante caracterizada clinicamente por um aumento dos níveis de colesterol LDL no plasma, conduzindo à sua acumulação principalmente nos tendões (xantomas tendinosos) e nas artérias. Devido à acumulação de lípidos nas artérias, estes indivíduos desenvolvem aterosclerose muito cedo, tendo eventos cardiovasculares prematuramente. A FH apresenta uma frequência de 1/500, na forma heterozigótica, na maioria das populações europeias. Em Portugal estima-se que existam cerca de 20 000 casos de FH. A identificação clínica da FH é possível, mas apenas o diagnóstico molecular da FH permite a correta identificação da doença, fundamentando a instituição de terapêutica farmacológica mais agressiva e/ou precoce, com a consequente redução do risco cardiovascular nos indivíduos afetados. Geneticamente esta patologia caracteriza-se por mutações em três genes: LDLR, APOB e PCSK9. No entanto, a percentagem de indivíduos identificados molecularmente situa-se entre 30-80% dependendo da população estudada, uma vez que em Portugal apenas 40% dos doentes com diagnóstico clínico de FH apresentam uma mutação causadora de doença num dos três genes associados à FH. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF) tem como objetivos a realização de um estudo epidemiológico para a determinação da prevalência e distribuição da FH em Portugal, tendo implementado o estudo molecular desta doença. Para tal, a caracterização funcional de alterações encontradas em genes associados à FH é de extrema importância pois permite obter um diagnóstico definitivo de FH. O objetivo deste trabalho doutoral era identificar e caracterizar a causa genética da hipercolesterolemia em famílias sem mutação identificável nos genes LDLR e APOB pelas metodologias usualmente utilizadas. A primeira parte do presente foi dedicada à reorganização do diagnóstico molecular da FH e à pesquisa de mutações num novo gene – PCSK9 –, à pesquisa de grandes rearranjos através da técnica de MLPA, bem como ao estudo dos genes APOB e LDLRAP1 através de duas abordagens diferentes da técnica de pirosequenciação. No total foram estudados no EPHF 642 casos índex (CI) (250 crianças e 392 adultos), tendo sido identificada uma alteração em 294 indivíduos. A reorganização do EPHF permitiu identificar 6 grandes rearranjos através da técnica de MLPA, identificando deste modo mais 19 indivíduos e 4 alterações no gene PCSK9 em 5 CI. Através da técnica de pirosequenciação, identificaram-se 10 novas alterações potencialmente patogénicas no gene APOB em 10 indivíduos e 4 alterações no gene LDLRAP1 em 4 CI. A segunda parte do trabalho incluído nesta tese centrou-se na análise funcional de alterações cuja patogenicidade era desconhecida, uma vez que dos 294 CI com uma alteração apenas 192 CI apresentam uma mutação comprovadamente patogénica. Desta forma, foram analisadas funcionalmente para o gene LDLR 11 alterações de splicing, uma alteração no promotor e 4 alterações pontuais. Verificou-se que 8 alterações de splicing e 3 alterações missense eram patogénicas, e que 3 alterações de splicing e 1 alteração missense não originavam doença. No gene APOB foram estudadas funcionalmente 4 alterações, das quais apenas 2 destas são patogénicas. Estas mutações foram as primeiras descritas fora da região consensus de ligação do ligando ao LDLR postulada anteriormente. Na impossibilidade da caracterização funcional de todas as alterações cujo estudo não tinha sido realizado, foi desenvolvida uma classificação com base em 6 programas bioinformáticos para as alterações missense e 3 programas para as alterações de splicing. Com base nesta classificação, identificaram-se 435 CI (175 CI e 260 familiares) com diagnóstico definitivo de FH, e 196 indivíduos (116 CI e 80 familiares) apresentavam um diagnóstico provável, 79 um diagnóstico possível e 46 neutro. Verificou-se que 594 indivíduos apresentavam uma alteração no gene LDLR, 30 indivíduos têm uma alteração no gene APOB e 7 indivíduos no gene PCSK9. A terceira parte deste trabalho doutoral teve como objetivo correlacionar o genótipo vs com o fenótipo de todos os CI referenciados ao EPHF, tendo por base os diferentes diagnósticos moleculares que foram obtidos através da classificação das alterações com e sem estudos funcionais. A comparação dos fenótipos apresentados por crianças e adultos com diferentes tipos de mutação revelou que, embora em idade pediátrica o fenótipo não dependa do tipo de mutação, na idade adulta já existe uma clara diferença de fenótipos entre portadores de mutações nulas e missense. Esta observação reforça a importância do diagnóstico molecular precoce de modo a estratificar o risco cardiovascular no grupo pediátrico, uma vez que as crianças com mutações nulas apresentam um maior risco cardiovascular, necessitando por isso de um aconselhamento especializado e implementação ainda mais precoce de terapêuticas hipolipemiantes. A última parte deste trabalho focou-se na realização do estudo de sequenciação de exoma a 5 CI com diagnóstico clínico de FH, mas sem uma mutação identificada num dos 3 genes associados à FH. Uma vez que a sequenciação de exoma origina uma quantidade elevada de dados por amostra, de modo a restringir a análise, foi realizada uma seleção de 49 genes associados ao metabolismo lipídico, tendo-se verificado a existência de 20 alterações distribuídas por 17 genes. Através deste estudo, identificaram-se 2 alterações no gene FLT1 em 2 CI não relacionados e 1 alteração no gene SORT1 noutro CI que cossegregam com a hipercolesterolemia na família. Os estudos funcionais das alterações encontradas nestes genes serão importantes para classificar as mesmas quanto à sua patogenicidade. No caso de se comprovar que alguma destas alterações é funcional, esta será a primeira evidência de um quarto gene associado a FH. Uma vez que a FH se encontra sub-diagnosticada em Portugal, o diagnóstico e aconselhamento genético da FH são importantes para a correta perceção e prevenção do risco familiar de DCV. Nas crianças e adolescentes, o diagnóstico genético é ainda mais importante, uma vez que se sabe que o risco cardiovascular é elevado, mas evitável, se medidas preventivas forem colocadas em prática. O futuro passa pela prevenção, em vez da resolução tardia das complicações cardiovasculares inerentes a esta patologia.[ENG] Familial Hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized clinically by an increase in the levels of blood LDL-cholesterol that leads to lipid accumulation in tendons (xanthomas), premature atherosclerosis and coronary heart disease (CHD). FH has a heterozygous frequency of 1/500 in most European populations. It is estimated that Portugal should have about 20 000 cases of FH. The clinical identification of FH is possible but only the molecular diagnosis of FH allows the correct identification of the disease and justifies a more aggressive and/or early initiation of drug therapy, with consequent reduction in cardiovascular risk in affected individuals. Genetically this disorder is characterized by mutations in three genes: LDLR, APOB and PCSK9. However the percentage of individuals identified molecularly is between 30-80% depending on the population studied; in Portugal only 40% of patients have an identified mutation, so other mutations in these genes or other gene defects should exist to explain the cause of hypercholesterolemia in the remaining families. The general objective of the Portuguese Familial Hypercholesterolemia Study (PFHS) is to carry out an epidemiological study in order to determine the prevalence and distribution of FH in Portugal and to better understand the CHD. The main aim of the PFHS is to identify the genetic cause of the dyslipidemia in patients with clinical diagnosis of FH. The functional characterization of alterations found in genes associated with FH is extremely important for FH diagnosis because it leads to a definite diagnosis of FH. The aim of this doctoral work was to identify and characterize the genetic cause of hypercholesterolemia in families without identified mutations in LDLR and APOB genes by methods commonly used. The first part of this doctoral work consisted in the reorganization of the molecular diagnosis of FH, the detection of mutations in a novel gene, the PCSK9 gene, to the screening of large rearrangements by MLPA, and the sequencing of APOB and LDLRAP1 using two different approaches other than pyrosequencing. The PFHS identified a total of 642 patients (250 children and 392 adults) and an alteration was identified in 294 individuals. The reorganization of PFHS allowed the identification of 6 major rearrangements by MLPA technique, thereby identifying 19 more individuals with FH; 4 alterations in PCSK9 gene in 5 index patients. Through pyrosequencing technique 10 alterations in APOB gene in 10 individuals and 4 alterations in gene LDLRAP1 in 4 patients were identified. In a second part of the project, the work was focused on the functional analysis of alterations with unknown pathogenicity, as among 294 patients with an alteration only 192 patients have a proven pathogenic mutation. So, functional studies were performed for 11 splicing alterations in the LDLR gene, one alteration in the promoter region and 4 missense alterations. It was found that 8 splicing alterations and 3 missense alterations were pathogenic and 3 splicing alterations and one missense were not cause of disease. Functional studies were performed for 4 alterations found in the APOB gene, 2 of which were identified as pathogenic. These mutations were the first mutations ever described outside the previously postulated consensus region of the ligand binding to the LDLR. Since it was not possible to functionally characterize all alterations found, an in silico classification was developed based on 6 bioinformatic programs for missense alterations and 3 programs for splicing alterations. Based on these classification, 435 index cases (175 CI and 260 relatives) had a definite diagnosis of FH, 196 individuals (116 CI and 80 relatives) had a probable diagnosis, 79 a possible diagnosis and 46 were neutral. It was found that 594 subjects had an alteration in the LDLR gene, 30 individuals had an alteration in the APOB gene and 7 in the PCSK9 gene. Another aim of this study was to correlate the genotype with phenotype for all patients referenced to PFHS based on the different molecular diagnostics that were obtained through the classification of the alteration with and without functional studies. Comparison of the phenotypes displayed by children and adults with different types of mutation revealed that children bearing null allele mutations did not present a different phenotype from other mutation type carriers, but the same was not observed for adult patients. This emphasizes that early diagnosis is important for cardiovascular risk stratification of young patients. The last part of this study focused on exome sequencing of 5 patients with clinical diagnosis of FH but without a mutation identified in genes associated with FH. As exome sequencing produces a large amount of data per sample, a selection of 49 genes associated with lipid metabolism was implemented to restrict the analysis, and 20 alterations distributed over 17 genes were identified. Through this study two alterations in FLT1 gene in 2 unrelated patients and one alteration in the SORT1 gene in one patient were identified and found to co-segregate with hypercholesterolemia in the family. Functional studies of these alterations are required to prove pathogenicity. If any of these alterations is shown to be disease-causing, this will be the first evidence for novel genes causing FH. Information on the molecular basis of the disease allows correct diagnosis and appropriate therapeutic measures. Genetic diagnosis allows also early identification of relatives at risk, reducing their cardiovascular risk thus leading to an improvement in their quality of life and life expectancy.Ana Catarina Alves foi bolseira de Doutoramento da Fundação para a Ciência e Tecnologia do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior SFRH/BD/27990/2006