Desenvolvimento de um ensaio para genotipagem do vírus da Hepatite C numa população de infectados em ambiente prisional

Dissertação de mestrado em Biologia (Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2011.[PT] O vírus da hepatite C (VHC) é caracterizado por uma elevada variabilidade genética traduzida na sua classificação em 6 diferentes genótipos, e em mais de 80 subtipos com distintos padrões de distribuição epidemiológica no mundo. Os vários genótipos estão associados a uma diferente evolução da infecção e progressão da doença, sendo por isso a classificação do VHC a principal ferramenta do clínico para a determinação da dosagem e duração do tratamento dos doentes. O presente estudo pretendeu desenvolver um método alternativo de genotipagem e subtipagem do VHC, no contexto de um laboratório de referência, que permitisse por um lado, reduzir os custos, e por outro lado, obter uma melhoria na classificação do vírus. No presente trabalho foram analisadas amostras de referência e amostras clínicas de 72 reclusos infectados por VHC, com resultados previamente conhecidos dos níveis de RNA e de genotipagem obtidos pelo método comercial LiPA. As amostras foram sujeitas a extracção de RNA e síntese de cDNA, amplificação por heminested PCR e sequenciação, e ainda, a análise filogenética de sequências nucleotídicas das regiões C/E1 e NS5B do VHC. Os resultados foram comparados com os previamente conhecidos obtidos pelo método LiPA. Independentemente das regiões genómicas, a subtipagem do VHC pelo método desenvolvido foi conseguida em 95,8% (69/72) dos casos, uma proporção bastante superior comparativamente à obtida no método LiPA (47,2%, 34/72), mostrando assim um melhor desempenho em identificar ou discriminar o subtipo VHC. Informação molecular conjunta para as duas regiões genómicas foi obtida em 88,9% (64/72) dos casos com identificação de um recombinante intergenótipo 1b/2k e um recombinante intragenótipo 2q/2k para a região C/E1 e 2k/2a para a região NS5B. Adicionalmente, 2 casos apresentaram uma classificação de VHC discordante, 1b/4a e 3a/4a, respectivamente para as regiões C/E1 e NS5B analisadas. Contudo, nestes casos não foi possível descartar a hipótese de possíveis infecções mistas. O elevado desempenho do método desenvolvido na detecção e classificação do VHC pode possibilitar de um modo mais preciso uma correlação clínica com os subtipos virais do VHC, e deste modo viabilizar um melhor entendimento do papel da variabilidade genómica na história natural e progressão da infecção do VHC.[ENG] The hepatitis C virus (HCV) is characterized by a high genetic variability which is reflected in their classification into 6 different genotypes, and in more than 80 subtypes with distinct epidemiological patterns of distribution in the world. The several HCV genotypes are associated with a different evolution of infection and disease progression, and therefore the HCV classification is the clinician main tool to determine the patients’ treatment dosage and duration. This study aimed to develop an alternative method of HCV genotyping and subtyping, in the context of a reference laboratory, to enable lower costs, and the other hand, to obtain an improvement in virus classification. In this work we analyzed reference samples and clinic specimens from 72 HCV-infected inmates, with previously known results of HCV viral load and genotyping obtained using the commercial method, LiPA. The samples were subjected to RNA extraction and cDNA synthesis, amplification by heminested PCR and sequencing, and also, to phylogenetic analysis of C/E1 and NS5B nucleotide sequences. The results were compared with those previously obtained by LiPA. Regardless of the genomic regions, the HCV subtyping with the developed method was achieved for 95.8% (69/72) of cases, a much higher success rate when compared with 47.2% (69/72) in LiPA. It showed a better performance in identifying or discriminating the HCV subtype when using the method developed The joint molecular information for the two genomic regions was obtained in 88.9% (64/72) of cases with identification of an intergenotypic recombinant form 1b/2k, and an intragenotypic recombinant 2q/2k for C/E1 region and 2k/2a for NS5B region. Additionally, 2 cases showed a discordant HCV classification, 1b/4a and 3a/4a, respectively for the analyzed regions, C/E1 and NS5B. However, in these cases it was not possible to discard the hypothesis of possible mixed infections. The high performance of the developed method in HCV detection and classification may allow a more precise clinic correlation with the HCV subtypes, and thus to enable a better understanding of the genomic variability’s role in natural history and progression of HCV infection