Estudo Bioquímico e Molecular de Famílias com Hipercolesterolemia Familiar

Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012.Dissertação defendida e aprovada em 10 de Dezembro de 2012.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP, Grupo de Investigação Cardiovascular (Setembro 2011 – Setembro 2012).Mafalda Bourbon: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPIntrodução: A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma patologia genética, caracterizada clinicamente por um aumento dos níveis de colesterol-LDL (c-LDL) no plasma, sendo maioritariamente causada por mutações no gene do receptor das LDL (gene LDLR). Mutações missense nos genes APOB ou PCSK9 podem causar fenótipos semelhantes. A FH sozinha ou em conjugação com outros factores de risco cardiovasculares pode promover o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCVs) prematuras. De acordo com a frequência da doença (1:500 indivíduos) estima-se que em Portugal existam cerca de 20.000 doentes com FH, porém esta encontra-se sub-diagnosticada. Até à data, apenas foram diagnosticados aproximadamente 550 doentes. O método de cascade screening (CS) permite a rápida identificação de indivíduos com FH numa família e foi descrito como custo-efectivo na identificação de novos doentes com FH. Objectivos: O principal objectivo deste trabalho foi, através do CS, aumentar o número de casos identificados com FH. Pretendeu-se ainda realizar a caracterização bioquímica de casos índex e respectivos familiares com FH, a fim de tentar correlacionar o genótipo e o fenótipo destes e compreender de que forma a FH e outros factores de risco cardiovascular influenciam o desenvolvimento de DCVs nesta população. Métodos: Para alcançar os objectivos propostos, estudaram-se 45 famílias, perfazendo um total de 194 indivíduos, 45 casos índex (cujo estudo molecular já havia sito realizado) e 149 familiares. As amostras de soro de casos índex e familiares foram analisados por electroforese de lipoproteínas para avaliação da presença de sdLDL e por métodos enzimáticos e colorimétricos automatizados para determinar a concentração de sdLDL e outras apolipoproteínas no soro. Após extracção de DNA dos familiares realizou-se a amplificação e sequenciação dos exões em que se detectou uma mutação no respectivo caso índex (gene LDLR, APOB). Foi ainda determinado o genótipo APOE de todos os indivíduos estudados. Os resultados da sequenciação foram analisados através do software staden package. Por fim realizou-se uma análise estatística de forma a interpretar os resultados obtidos. Resultados: A partir do estudo molecular aos 149 familiares, foram diagnosticados com FH 83 indivíduos (20 crianças e 63 adultos). Determinou-se que 71,79% das crianças e 76,62% dos adultos apresentam um genótipo APOE E3/E3, não se obtendo diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes alelos e o perfil bioquímico. Relativamente à estratificação das sdLDL, 65,52% das crianças e 72,88% dos adultos apresentam, maioritariamente, subfracções maiores e menos densas das LDL. Observou-se ainda que os níveis de Lipoproteína(a) são tendencialmente superiores em indivíduos com DCV. Da amostra total, 47,93% dos indivíduos com FH não estão ainda medicados. Porém, mesmo os indivíduos medicados apresentam um perfil lipídico de risco para o desenvolvimento de uma DCV prematura. Conclusão: O CS é um método cujo custo-benefício é extremamente eficaz. Sendo, no entanto, necessário, aumentar a adesão dos familiares. O CS permite identificar precocemente indivíduos com FH, que apresentam elevado risco cardiovascular, necessitando de intervenções farmacológica e de controlo de outros factores de risco adequadas. Os resultados obtidos demonstram que mais de 50% dos casos não tem o seu risco cardiovascular controlado, sendo essencial uma melhor compreensão sobre a dinâmica existente entre as DCVs e a FH.[eng]Familial Hypercholesterolemia (FH) is a genetic condition, clinically characterized by increased levels of LDL-cholesterol circulating in plasma and is mainly caused by mutations in receptor LDL (LDLR gene), but missense mutations in APOB and PCSK9 genes may also cause similar phenotypes. FH combined with the presence of other cardiovascular risk factors, may promote the development of premature cardiovascular diseases (CVD). According to the frequency of FH (1:500 individuals) estimated in Portugal, there are about 20.000 cases of FH, but is under-diagnosed. To date, only approximately 550 FH patients were identified. The Cascade Screening (CS) method allows the rapid identification of FH individuals with a family and was described as a cost-effective method to identify new FH patients. Objectives: The main goal of this work is, through CS, increase the number of individuals diagnosed with FH. It is also proposed to perform a biochemical characterization of index cases with FH and their relatives to try to correlate genotype and phenotype of these subjects and understand how the FH and other cardiovascular risk factors may influence the development of CVD in our population. Methods: To achieve these objectives we studied 45 families in a total of 194 individuals: 45 index cases (whose molecular study had already been done) and 149 relatives. Serum samples from index cases and relatives were analyzed for lipoproteins by electrophoresis and stratification of sdLDL. Through an automated enzymatic and colorimetric methods were quantified sdLDL and others apolipoproteins in serum samples, respectively. After de DNA extraction of relatives, the amplification and sequencing of the exon in which a mutation was detected in the respective index case (LDLR or APOB gene) was performed. It was further determined the APOE genotype for all the subjects in study. The sequencing results were analyzed using staden package software. At last, was performed a statistical analysis in order to interpret the results. Results: From the molecular study of 149 relatives, 83 were diagnosed with FH (20 children and 63 adults). It was determined that 71,79% of the children and 76,62% of the adults have E3/E3 APOE genotype. Through the sdLDL stratification, it was observed that 65.52% of children and 72.88% of adults have, mostly sub fractions larger and less dense LDL. It was also observed that the levels of Lipoprotein(a) tends to be higher in subjects with CVD. Of the total sample, 47,93% of individuals with FH are not yet treated. However, even individuals taking medication have a lipid risk for the development of a premature CVD. Conclusion: CS is a extremely cost-effective method. However, is necessary the increase of relatives adherence. The CS allows the early identification of individuals with FH who have high cardiovascular risk, requiring pharmacologic intervention and control of other cardiovascular risk factors. The results show that over than 50% of cases do not have their cardiovascular risk controlled and so is essential a better understanding of the dynamics between the CVD and FH