3-Metilcrotonilglcinuria: identificação e caracterização molecular

Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular e Celular apresentada apresentada à Universidade de Aveiro (Departamento de Biologia), 2009Laura Vilarinho: Investigadora Auxiliar do Centro de Genética Médica Jacinto Magalhães, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA, IP).O rastreio neonatal é um programa sistemático destinado a todos os recémnascidos, tendo como objectivo evitar a evolução da patologia rastreada através do diagnóstico pré-sintomático e da instituição precoce de terapia adequada. A 3-metilcrotonilglicinúria (MCG) é uma doença incluída no rastreio que até recentemente era considerada uma doença hereditária do metabolismo rara. Na MCG o catabolismo da leucina é bloqueado no quarto passo devido a deficiência da enzima 3-metilcrotonil-CoA carboxilase (3-MCC). A 3-MCC catalisa a conversão do 3-metilcrotonil-CoA a 3-metilglutaconil-CoA, uma reacção reversível dependente de ATP e utilizando o bicarbonato como fonte de grupos carboxílo. O diagnóstico bioquímico da deficiência em 3-MCC é caracterizado pelo aumento marcado dos ácidos 3-hidroxisovalérico (3-HIVA) e 3-metilcrotonilglicina (3-MCG) na urina e concentrações elevadas de 3- hidroxisovalerilcarnitina (C5-OH) no sangue. A caracterização molecular reside no estudo dos genes MCCA e MCCB que codificam a enzima 3-MCC. O objectivo deste trabalho foi estabelecer um diagnóstico etiológico em doentes com MCG detectados pelo Programa Nacional de Diagnóstico Precoce e que possuíam um valor de C5-OH, marcador bioquímico primário de rastreio para esta patologia, superiores ao cut-off estabelecido. Numa amostra de 20 doentes pretende-se identificar e caracterizar as mutações mais frequentes na nossa população recorrendo a análise de 19 exões no gene MCCA e 17 exões no gene MCCB. Destes casos seleccionados para estudo, foram detectadas 26 mutações das quais 16 não se encontram ainda descritas na literatura nem na base de dados Human Gene Mutation Database, o que corresponde a uma percentagem de novas mutações de 61.5%. Os resultados obtidos permitiram concluir que o génotipo não consegue predizer o fenótipo ou o risco metabólico destes casos, mas permite confirmar o diagnóstico nos casos duvidosos. A deficiência em 3-MCC ainda não é uma patologia completamente conhecida e a sua apresentação clínica é bastante heterogénea, sendo a maioria dos doentes portadores de mutações próprias não sendo visível uma correlação genótipo – fenótipo. A continuação deste estudo é necessária para encontrar marcadores genéticos e/ou bioquímicos que expliquem a razão pela qual um número relativamente reduzido de indivíduos apresenta risco de desenvolver um fenótipo severo da doença. Verificou-se também que o estudo molecular é importante no diagnóstico de portadores sintomáticos ou assintomáticos (diagnóstico preditivo), no diagnóstico pré-natal, aconselhamento genético e com indicação para suplementação com biotina para os pacientes que tem a mutação que responde à biotina.Newborn screening is a systematic program for all newborns (NB), aiming to prevent the development of the diseases traced through the diagnosis and early institution of adequate therapy. A 3- methylcrotonylglycinuria (MCG) is a disease included in the newborn screening that until recently was considered a rare inherited disorder of the metabolism. In the catabolism of leucine, MCG is blocked in the fourth step due to deficiency of the enzyme 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase (3-MCC). A 3- MCC catalyzes the conversion of 3-methylcrotonyl-CoA to 3-methylglutaconyl- CoA, a reversible reaction dependent of ATP and using bicarbonate as a source of carboxyl groups. The biochemical diagnosis of disability in 3-MCC is characterized by marked increase of acid 3-hydroxyisovaleric (3-HIVA) and 3-methylcrotonylglycine (3-MCG) in urine and high concentrations of 3-hydroxyisovalerylcarnitine (C5-OH) in the blood. The molecular characterization is the study of genes MCCA and MCCB that encodes the enzyme 3-MCC. The aim of this study was to establish an etiologic diagnosis in patients with 3- methylcrotonylglycine detected by the Expanded Newborn Screening and that had a value of C5-OH, primary biochemical marker screening for this condition, higher than the set cut-off. In a sample of 20 patients the study intends to identify and characterize the most frequent mutations in our population using an analysis of 19 exons in the MCCA gene and 17 exons in the MCCB gene. Of these cases selected for study, 26 mutations were detected of which 16 have not been described in the literature nor in the Human Gene Mutation Database, which is a percentage of new mutations of 61.5%. The results described in this thesis shows that the genotype cannot predict the phenotype or metabolic risk of these cases, but it is capable to confirm the diagnosis in doubtful cases. The 3-MCC deficiency is a pathology not completely understood and its clinical phenotype is very heterogeneous, most patients showing different mutations making the phenotype-genotype correlation difficult. More studies are needed to find genetic and / or biochemical markers that explain why a relatively small number of individuals are at risk of developing a severe disease phenotype. It is also important in the diagnosis of patients with symptomatic or asymptomatic (predictive diagnosis) in prenatal diagnosis, genetic counseling and provide indication for supplementation with biotin for patients who have a mutation that responds to biotin