Post-transcriptional regulation of HFE gene expression

Tese de doutoramento em Biologia (Genética Molecular) apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2010Tese defendida e aprovada em Abril de 2011Trabalho de investigação realizado no Departamento de Genética do INSA (Jan. 2006-Dez. 2009)Iron is a key element for numerous metabolic processes in living cells. The challenge for most organisms is to acquire the adequate amounts of iron for these processes yet avoiding the toxicity associated with free iron. In fact, disruptions of iron homeostasis account for some of the most common human diseases. Amongst these, lays hereditary hemochromatosis, which is mainly associated with mutations in the HFE gene, leading to iron overload in specific organs. HFE protein acts in iron homeostasis by regulating the expression of hepcidin in the liver. Besides the major HFE transcript, which is expressed at low levels in a wide range of human tissues, several additional alternative HFE transcripts have been described. The work presented in this dissertation addresses the characterization of HFE alternative transcripts, the biological mechanisms involved in their genesis as well as their physiological significance and regulation. A variety of human tissues was analysed and shown to express several alternatively spliced HFE transcripts. Functional analysis of the corresponding proteins revealed that alternative splicing can either generate non-functional HFE protein variants or produce a soluble HFE variant that is secreted by cells associated with beta2-microglobulin. This soluble HFE may have a vital role in iron homeostasis by acting as an agonist or antagonist of the full length HFE. Furthermore, HFE transcripts were found to be physiologically regulated by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD), since its levels are significantly increased when depleting human cells from a key NMD effector. Through the analysis of several human tissues, it is shown that HFE mRNA expression results from alternative cleavage and polyadenylation at four different sites. This tissue-specific polyadenylation pattern seems to respond to cellular iron status, acting coordinately with NMD to fine-tune HFE’s expression levels. The regulation of HFE gene expression is here shown to be post-transcriptionally influenced by alternative splicing, alternative polyadenylation and nonsense-mediated mRNA decay mechanisms. These findings may hint future directions in the active field of iron biology research and provide interesting cues that could be translated into new therapeutics for iron homeostasis disorders through the HFE-mediated regulation of hepcidin.O ferro é um elemento essencial em diversos processos metabólicos celulares. O desafio que se coloca para a maioria dos organismos prende-se com o controlo do ferro absorvido de modo a suprir as necessidades destes processos evitando, no entanto, os danos causados pelo ferro livre. Na realidade, algumas das doenças humanas mais comuns estão relacionadas com a perturbação da homeostase do ferro. Entre estas, encontra-se a hemocromatose hereditária que, estando maioritariamente associada a mutações no gene HFE, origina a acumulação de ferro em vários órgãos. A proteína HFE actua na homeostase do ferro através da regulação da expressão da hepcidina no fígado. O principal transcrito HFE apresenta baixos níveis de expressão numa série de tecidos humanos, tendo sido descritos diversos transcritos adicionais. O trabalho aqui apresentado aborda a caracterização dos transcritos alternativos de HFE, os mecanismos envolvidos na sua génese, assim como o seu possível papel fisiológico e regulação. A análise de diversos tecidos humanos permitiu identificar vários transcritos HFE resultantes de splicing alternativo. O estudo funcional de algumas proteínas correspondentes demonstrou que o processo de splicing alternativo pode gerar variantes não funcionais ou produzir uma variante HFE solúvel que é secretada pelas células associada à beta2-microglobulina. Esta proteína poderá desempenhar um papel crucial na homeostase do ferro, actuando como um agonista ou antagonista da HFE full length. Além disso, foi demonstrado que a expressão do transcrito HFE principal é fisiologicamente regulada pelo mecanismo de nonsense-mediated mRNA decay (NMD), dado que os seus níveis aumentam quando este mecanismo é inibido. A pesquisa realizada em tecidos humanos permitiu verificar que a expressão do mRNA HFE resulta da utilização de quatro locais de clivagem e poliadenilação alternativos. Este padrão de poliadenilação alternativa específico de tecido aparenta responder a estímulos de ferro, actuando coordenadamente com o NMD no ajustamento dos níveis de expressão de HFE. Esta dissertação demonstra que a regulação da expressão do gene HFE é influenciada pós-transcricionalmente pelos mecanismos de splicing alternativo, poliadenilação alternativa e NMD. Este conhecimento poderá conduzir a novas perspectivas de investigação na área do metabolismo do ferro e contribuir para o delinear de novas estratégias terapêuticas a aplicar em patologias de homeostase do ferro através da regulação da hepcidina.Fundação para a Ciência e a Tecnologia - Projecto PTDC/SAU/GMG/64494/2006 e Bolsa de Doutoramento SFRH/BD/21340/2005; Programa de Financiamento Plurianual do Centro de Investigação em Genética Molecular Humana (CIGMH