Modificación de la funcionalidad de la eritropoyetina por carbamilación. Mecanismos de acción sobre células eritroides y neuronales

La eritropoyetina (Epo) es conocida como la hormona que regula la producción de células eritroides. Sin embargo, su rol biológico se expandió a partir del hallazgo de la expresión de receptores específicos en otros tejidos, incluyendo el nervioso. Además, se describió un efecto neuroprotector de la hormona, el cual estaría asociado a inhibición de apoptosis. Debido al interés por expandir el uso farmacológico de la Epo hacia la protección de tejidos no hematopoyéticos, se intensificó la búsqueda de estructuras modificadas de la proteína. La entidad que merece, actualmente, mayor investigación es la Epo carbamilada en los residuos lisina (cEpo). Evidencia derivada de estudios in vitro y en animales de experimentación indican que esta forma de Epo mantiene su actividad neuroprotectora mientras que carece de actividad eritropoyética. Esta diferente función evitaría un aumento innecesario de la masa eritroide en el tratamiento de pacientes no anémicos con enfermedades neurodegenerativas. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre las diferencias observadas en la función de Epo debido a la carbamilación, en el presente trabajo se utilizó un modelo que involucra células fisiológicas y varias líneas celulares para evaluar, en conjunto y comparativamente, los efectos de cEpo y de Epo en ensayos paralelos. Fueron utilizados cultivos de células progenitoras eritroides de médula ósea de ratón, distintas líneas celulares con capacidad de diferenciación eritroide, tales como UT-7, dependiente de Epo para su supervivencia, TF-1, dependiente de GM-CSF y puede proliferar en presencia de Epo por períodos cortos y K562, independiente de factores de crecimiento específicos, así como la línea de origen neuronal SH-SY5Y. El primer paso consistió en realizar la carbamilación de Epo recombinante, utilizando cianato de potasio, empleando distintos tiempos y concentraciones de cianato apropiadas para asegurar un completo bloqueo de los residuos lisina de la Epo. El éxito de la carbamilación fue verificado mediante electroforesis en gel y Western blotting, demostrándose el aumento de la carga neta negativa de cEpo con respecto a la de Epo. La modificación de la estructura de la proteína por carbamilación puede causar alteraciones funcionales, cuyo estudio constituye el objetivo de este trabajo de tesis. Los cultivos de células UT-7 y TF-1 en presencia de cEpo mostraron una significativa disminución de la viabilidad celular, provocando la muerte celular por apoptosis, mientras que la Epo mantuvo la viabilidad e indujo la proliferación celular de ambas líneas celulares. La cEpo tampoco pudo estimular el desarrollo de unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) en cultivos de células de médula ósea de ratón, ni previno la apoptosis inducida por la citoquina proinflamatoria TNF-α en células eritroileucémicas K562. En cambio, cEpo, al igual que Epo, actuó como factor antiapoptótico frente a la inducción de muerte celular programada inducida por TNF-α o staurosporina en células neuronales SH-SY5Y. Los resultados de ensayos de inhibición de vías de señalización intracelular permiten sugerir que las acciones neuroprotectoras de Epo y cEpo son mediadas por la activación de Jak2/PI3K. Estos resultados confirmaron que las modificaciones moleculares introducidas en la molécula de Epo por el proceso de carbamilación generan la pérdida de su habilidad para mantener la supervivencia de las células con capacidad de diferenciación eritroide pero no afecta su acción neuroprotectora mostrando, en este caso, una actividad similar a la de la Epo nativa. Mediante ensayos competitivos y de inhibición por anticuerpos, tanto en las células SH-SY5y como en las TF-1, se observó que la Epo puede actuar a través del receptor homodimérico (REpo/REpo) y el heterodimérico formado por una subunidad REpo y una subunidad ß common (Rßc), que es también subunidad del receptor de GM-CSF. En cambio, cEpo necesita de las subunidades REpo y Rßc para prevenir la apoptosis de las células neuronales. A partir de la hipótesis de que la carbamilación de Epo le permite conservar su capacidad neuroprotectora pero le impide inducir la proliferación de células eritroides, el siguiente objetivo fue la investigación de vías de señalización que juegan un papel clave en la proliferación celular inducida por Epo. Si bien en cultivos de células eritroides UT-7 y TF-1 cEpo indujo la fosforilación de Jak2, primer paso de activación celular, demostramos por primera vez la incapacidad de cEpo para mantener la fosforilaión de Akt y FOXO3a por el mismo periodo que lo hace Epo. Esto lleva a la translocación de FOXO3a al núcleo promoviendo la expresión de la proteína regulatoria del ciclo celular p27Kip1 y generando, así, el arresto del ciclo celular por cEpo. Dado que el efecto diferencial de cEpo y Epo con respecto a la proliferación celular se encontraría asociado al silenciamiento de vías de señalización por aumento de la velocidad de defosforilación analizamos la expresión y actividad de una fosfatasa, la tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), involucrada en la desregulación de la señalización por Epo. Comprobamos que la inducción de PTP1B es significativamente mayor en presencia de cEpo, incremento que parece estar asociado al aumento de calcio intracelular inducido por este factor. La colocalización de PTP1B con el Rßc sustenta la conclusión de que la fosfatasa desfosforila la señalización de cEpo, interrumpiendo la vía de supervivencia y, en consecuencia, la proliferación celular, explicando, al menos en parte, la acción diferencial entre Epo y cEpo sobre células eritroides. Palabras claves: eritropoyetina carbamilada, eritropoyetina, proliferación celular, receptor de eritropoyetina, receptor ß common, tirosina fosfatasa 1B, eritropoyesis, neuroprotección