Dengue virus entry into the host cell

En la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección con dengue, resultando la enfermedad viral transmitida por artrópodos de mayor importancia en todo el mundo. A pesar de la creciente incidencia de este virus, al momento no existen vacunas o quimioterapia antiviral disponibles. Dado que el conocimiento del ciclo de multiplicación viral es indispensable como punto de partida para el diseño de agentes quimioterapéuticos, el presente trabajo de tesis se propuso estudiar los pasos iniciales de la infección con DENV: el mecanismo de entrada a la célula huésped. Nuestro estudio se centralizó en el análisis in vitro de los factores celulares involucrados en la internalización, transporte intravesicular y desnudamiento del virus y la influencia del tipo de célula (mamífero o insecto), cepa y serotipo viral sobre dichos procesos. Mediante el uso combinado de inhibidores químicos y moleculares, medidas de infectividad y técnicas de microscopía electrónica y de fluorescencia demostramos que la entrada del serotipo DENV-1 en células Vero ocurre por endocitosis dependiente de clatrina, mientras que la entrada del serotipo DENV-2 tiene lugar por un mecanismo no clásico independiente de clatrina, caveolas y lipid-rafts, pero dependiente de dinamina. Al extender nuestro estudio a otros sistemas celulares (C6/36 HT y A549) encontramos que la endocitosis de DENV-1 y DENV-2 ocurre por un mecanismo clásico dependiente de clatrina. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que un mismo serotipo viral puede utilizar diferentes vías de entrada en líneas celulares de distinto origen, y que a su vez, distintos serotipos virales pueden utilizar vías de entrada alternativas en un mismo tipo celular. Asimismo, observamos que en todos los sistemas celulares analizados, la entrada de DENV ocurre con dependencia de la exposición de los viriones a pH ácido. Esto implica un tránsito de las partículas virales en compartimentos endosomales hasta el momento en que se dispara la fusión entre la membrana viral y la membrana de la vesícula transportadora. Encontramos que los viriones son primeramente transportados hacia endosomas tempranos para luego continuar hasta endosomas tardíos o endosomas de reciclaje dependiendo de características propias de cada cepa viral. Por lo tanto, los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de este importante patógeno humano, sino que además proveen una nueva perspectiva para encarar el desarrollo racional de agentes antivirales para esta enfermedad de creciente reemergencia global.At present, nearly half of the world population is at risk of dengue infection, resulting in the arthropod-borne viral disease of major importance worldwide. Despite the increasing incidence of this virus, there are no vaccines or antiviral chemotherapy available. Since knowledge of the viral multiplication cycle is essential as a starting point for the design of chemotherapeutic agents, this thesis aimed to examine the initial steps of DENV infection: the mechanism of virus entry into the host cell. Our study was centered in the in vitro analysis of the cellular factors involved in the internalization, intravesicular transport and penetration of the virus and the influence of the cell type (mammalian or insect), strain and serotype in these processes. Through the combined use of chemical and molecular inhibitors, infectivity assays and electron and fluorescence microscopy techniques we show that the entry of the serotype DENV-1 in Vero cells occurs by clathrin-mediated endocytosis, while entry of DENV-2 takes place by a nonclassical mechanism independent of clathrin, caveolae and lipid-rafts, but dependent on dynamin. By extending our study to other cell systems (C6/36 HT and A549) we found that endocytosis of DENV-1 and DENV-2 occurs by a classical clathrin-dependent mechanism. Therefore, these results demonstrate for the first time that the same serotype may use diverse pathways in cell lines of different origin, and in turn, different serotypes can use alternative entry pathways in the same cell line. We also observed that in all cell systems analyzed by us, the entry of DENV occurs with dependence of exposure of the virions to acidic pH. This implies a transport of viral particles in endosomal compartments until fusion between the viral membrane and the membrane of the carrying vesicle is triggered. We found that virions are first transported to early endosomes and then continue to late endosomes or recycling endosomes depending on characteristics of each viral strain. Therefore, the findings presented here not only provide basic knowledge about the initial steps of the replication cycle of this important human pathogen, but also provide a new perspective to address the rational development of antiviral agents against this re-emerging global disease.Fil:Acosta, Eliana Gisela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina