Negative regulation of neurotrophic factor receptor signaling in developing neurons

Los factores neurotróficos son proteínas solubles principalmente conocidas por su participación en el mantenimiento, sobrevida, diferenciación y maduración sináptica de diferentes subpoblaciones neuronales. Distintas familias de factores neurotróficos han sido identificadas en el sistema nervioso de mamíferos, entre las que se destacan el grupo de las neurotrofinas (NGF, BDNF, NT3, NT4) y la familia del factor neurotrófico derivado de la glia (GDNF, NRTN, ARTN, PSPN). Las señales inducidas por estos ligandos involucran la activación de receptores conteniendo una actividad tirosina kinasa intrínseca, un evento de señalización clave para controlar la fisiología celular y orquestar el desarrollo del sistema nervioso. Un fuerte control y regulación de la actividad de los receptores tirosina kinasa (RTK) es crucial para garantizar la homeostasis celular y un apropiado desarrollo neuronal, ya que tanto alteraciones funcionales de estos receptores por mutaciones en los correspondientes genes como fallas en los mecanismos que restringen su activación, podrían contribuir a la patogénesis de ciertos tipos de cáncer y de enfermedades neurológicas. De esta manera, para evitar errores de señalización que finalmente lleven a comportamientos celulares aberrantes y patologías, los mecanismos celulares han evolucionado para permitir que apropiados niveles de activación de estos receptores sean alcanzados y mantenidos por un período de tiempo compatible con la inducción de una respuesta fisiológica. El objetivo de la presente tesis consistió en identificar y caracterizar nuevos mecanismos que restringen la activación de receptores para factores neurotróficos en neuronas en desarrollo, como una vía para entender la patogénesis de diferentes enfermedades neurológicas, y así contribuir al desarrollo de nuevas terapias regenerativas. Inicialmente, identificamos y caracterizamos a la proteína Sprouty4 como un inhibidor endógeno de la señalización y el crecimiento axonal inducidos por NGF y su receptor TrkA en neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Por otro lado, nosotros también analizamos el rol de los miembros de la familia de proteínas Lrig – Lrig1, Lrig2 y Lrig3 – como moduladores endógenos del estado de activación de receptores para factores neurotróficos. Las proteínas Lrig pertenecen a una emergente superfamilia de proteínas transmembrana enriquecidas en sistema nervioso que contienen dominios inmunoglobulina (Ig) y repeticiones ricas en leucina (LRR - Leucine-rich repeats). En este sentido, identificamos a Lrig1 como un regulador negativo de la señalización y los efectos biológicos inducidos por BDNF y su receptor TrkB en neuronas hipocampales. Notablemente, hemos determinado que los ratones transgénicos deficientes para Lrig1 poseen una mayor arborización dendrítica en las neuronas piramidales del hipocampo que correlaciona con defectos en su comportamiento de interacción social, aportando nuevas evidencias de su relevancia fisiológica. Por último, realizamos experimentos que demuestran que los tres miembros de la familia Lrig, cooperarían para inhibir el crecimiento neurítico inducido por GDNF, controlando el estado de activación de su receptor tirosina kinasa Ret en células neuronales. De esta manera, en este trabajo de tesis doctoral hemos identificado nuevos determinantes moleculares relevantes para el control de la conectividad y el armado de los circuitos neuronales, a través de la regulación de procesos de crecimiento axonal y dendríticos inducidos por factores neurotróficos en el sistema nervioso central y periférico. Palabras clave: RTK, factores neurotróficos, Lrig, Sprouty4, NGF, BDNF, GDNF, Ret, TrkA, TrkB, hipocampo, ganglios de la raíz dorsal (DRG).Neurotrophic factors are soluble proteins mainly known for their roles in the maintenance, survival, differentiation and synaptic maturation of different neuronal subpopulations. Different families of neurotrophic factors have been identified in the mammalian nervous system, including the neurotrophins (NGF, BDNF, NT3, NT4) and the glial cell-line derived neurotrophic factor family ligands (GDNF, NRTN, ARTN, PSPN). Signaling induced by these ligands involves the activation of receptors containing a tyrosine kinase intrinsic activity, a key event to control cell physiology and orchestrate the development of the nervous system. A tight control and regulation of the activity of receptor tyrosine kinases (RTK) are crucial to ensure proper cell homeostasis and neuronal development, as both functional alterations of these receptors by gene mutations and failures on the mechanisms that restrict their activation may contribute to the pathogenesis of certain types of cancer and neurological diseases. Therefore, to avoid signaling errors that could eventually lead to aberrant and pathological cellular behaviors, the cellular mechanisms have evolved to allow that appropriate signaling thresholds are reached and maintained for a period of time compatible with the induction of a physiological response. The aim of this thesis was to identify and characterize new mechanisms that restrict the activation of neurotrophic factor receptors in developing neurons, as a way to understand the pathogenesis of some neurological diseases, thus contributing to the development of new regenerative therapies. First, we identified and characterized Sprouty4 protein as an endogenous inhibitor of TrkA-dependent downstream signaling and NGF-induced axonal growth of primary dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons. On the other hand, we also analyzed the role of Lrig protein family members – Lrig1, Lrig2 and Lrig3 – as endogenous modulators of neurotrophic factor receptor activation. Lrig proteins belong to a novel superfamily of transmembrane proteins enriched in nervous system containing immunoglobulin-like (Ig) and leucine-rich repeat domains (LRR). Here, we identified Lrig1 as a negative regulator of TrkB signaling and biological effects induced by BDNF in hippocampal neurons. Interestingly, we have determined that Lrig1-null transgenic mice have increased dendrite morphogenesis and dendritic arborization of CA1 and CA3 hippocampal pyramidal neurons, suggesting that Lrig1 could increase the repertoire of TrkB signaling outputs to allow hippocampal neurons to sculpt distinctive dendrite patterns. In addition, Lrig1 ablation was also associated with social motivation/interaction deficits, providing new insights into its physiological importance. Finally, we conducted a set of experiments showing that the three Lrig family members cooperate to inhibit GDNF-promoted neurite outgrowth by controlling the activation state of the tyrosine kinase receptor Ret in neuronal cells. In conclusion, in this manuscript we have identified novel molecular determinants, relevant to control connectivity and neural circuits assembly through the regulation of axonal and dendritic growth induced by neurotrophic factors in peripheral and central nervous system. key words: RTK, Neurotrophic factors, Lrig, Sprouty4, NGF, BDNF, GDNF, Ret, TrkA, TrkB, hippocampus, dorsal root ganglia (DRG).Fil:Alsina, Fernando Cruz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina