Studies of RNA structures that regulate dengue virus replication in human and mosquitoes

El virus de dengue es el principal patógeno humano transmitido por mosquitos para el cual aún no existen tratamientos antivirales efectivos. El genoma viral es una molécula de ARN compuesta por un único marco de lectura abierto flanqueado por las regiones 5' y 3' no codificantes. Mediante la manipulación genética de clones infecciosos y ensayos funcionales hemos, demostrado que la estructura del ARN en los extremos del genoma es dinámica y que la formación regulada de conformaciones alternativas es necesaria para la síntesis del ARN viral en células de mamíferos. Experimentos complementarios en células de mosquito confirmaron además la importancia de este fenómeno en ambos hospedadores y permitieron detectar una secuencia en el extremo 3' del genoma que funciona como un determinante específico para la replicación del virus en insectos. Por otro lado, la combinación de estudios de mapeo químico y análisis de conservación de la región 3' no codificante han revelado la existencia de estructuras de ARN que se mantienen conservadas entre distintos flavivirus transmitidos por insectos. El análisis de esta región mediante experimentos de adaptación en células y técnicas de secuenciación masiva ha permitido caracterizar una estructura de ARN que se adapta de manera diferencial durante la infección en mosquitos y mamíferos. Además a través de ensayos de mutagénesis dirigida y el estudio del fitness viral en células y mosquitos adultos se demostró que la duplicación de dicha estructura facilita la alternancia de hospedadores con requerimientos diferentes. En conjunto los resultados de esta tesis proveen nuevos conocimientos sobre la biología del dengue de posible utilidad para el desarrollo racional de estrategias antivirales. Asimismo, la información aquí presentada permitirá entender aspectos epidemiológicos y evolutivos de virus de ARN transmitidos por insectos con relevancia en salud pública.Dengue virus is the most important mosquito-borne human pathogen for which there are no vaccines and no effective antiviral treatments available. The viral genome is an RNA molecule coding for a single open reading frame flanked by highly structured 5' and 3' non coding regions. Using infectious clones and evaluating replication of recombinant viruses, we have demonstrated that the ends of the viral genome are dynamic and that the regulation of alternative conformations of the viral RNA is crucial for infectivity. Additional experiments using mosquito cells confirmed the relevance of our findings for mosquito and human hosts, and allowed the identification of specific sequence requirements for viral replication in insects. Furthermore, by combining chemical probing and sequence conservation analysis of viral 3' non coding regions, the existence of RNA structure motifs that are conserved in mosquitoborne flaviviruses was demonstrated. In this regard, new models and patterns of 3’UTR conservation among all known flaviviruses were constructed. Employing host adaptation assays and deep sequencing analysis, different viral populations were characterized from distinct hosts. Interestingly, the sequence variations detected modified the secondary structure of a single RNA structure. Mutational analysis and virus fitness measurements in mosquito cells and infected mosquitoes showed the requirement of RNA structure duplication as a mechanism to maintain high viral fitness during host mosquito-human switch. Together, these results provide new knowledge about dengue virus biology useful for rational development of antiviral strategies. Importantly, in these studies we present new mechanisms of virus-host adaptation that will help the understanding of epidemiological and evolutionary aspects of viral pathogens transmitted by insects.Fil:Villordo, Sergio Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina