Molecular and functional analyses of chlorophyll deficient cytoplasmic lines originated from a chloroplast mutator gene

Los cloroplastos son organelas exclusivas de la célula vegetal y en ellas se produce uno de los procesos más fundamentales de la vida terrestre que es la fotosíntesis. Las mismas poseen su propio ADN o plastoma que se hereda de manera citoplasmática. El plastoma está altamente conservado observándose poca variabilidad natural y la inducción artificial de mutaciones ha sido dificultosa. En el Instituto de Genética se caracterizó genéticamente un gen mutador de cloroplastos en cebada que induce un amplio espectro de mutaciones plastómicas. En este trabajo de tesis se analizaron y caracterizaron fisiológica, bioquímica y molecularmente tres mutantes aisladas a partir del genotipo mutador, las líneas citoplásmicas LC2, LC3 y LC9. Para la mutante LC9, de tipo virescente, no se hicieron postulaciones sobre posibles genes candidatos, sin embargo, de acuerdo a los resultados del análisis de RFLPs pudo concluirse que esta línea mutante no porta grandes rearreglos o deleciones en el plastoma. En el caso de la mutante LC2, de tipo albo-viridis, los resultados de determinación de pigmentos y proteínas codificadas por el plastoma en experimentos de imbibición de las semillas con antibióticos que inhiben la traducción plastídica, sugirieron que las plántulas LC2 tienen un retraso en la síntesis de proteínas plastídicas en la parte superior de la lámina de la primera hoja, proceso que en el caso de la cebada normal se produciría antes de la germinación. El único gen en el plastoma involucrado en la regulación de la traducción cloroplástica es el gen infA, que fue postulado como candidato del fenotipo LC2. Luego de su secuenciación se halló una mutación puntual que produce un cambio de aminoácido en la proteína IF1 ("initiation factor 1"). Se concluyó que se trata de una mutante del gen infA, siendo la primera vez que un fenotipo mutante es atribuido a este gen en plantas superiores. Además, el fenotipo LC2 se vió estrechamente asociado a mutaciones en el gen infA como claramente se demostró mediante el aislamiento de nuevas mutantes tipo LC2 (LC2-like). En el caso de la mutante LC3, de tipo viridis y sensible a alta temperatura, se analizó la composición de clorofilas y carotenoides demostrándose que LC3 tiene un menor contenido de clorofilas totales en comparación con el control, sobre todo a alta temperatura. Los resultados del contenido de pigmentos del ciclo de las xantofilas indicaron que la mutante sufre de estrés fotooxidativo. También se realizaron mediciones de los espectros de fluorescencia de la clorofila a temperatura ambiente y a 77 K, y éstos demostraron fotoinhibición y un fotosistema I (PSI) afectado en LC3. A nivel de proteínas de las tilacoides, se encontró que en LC3 estaban disminuidos o ausentes algunos polipéptidos componentes del PSI cuando la mutante creció en condiciones de luz y temperatura determinadas. A partir de estos resultados se postularon como responsables los loci ycf3 e ycf4, que codifican para dos chaperoninas involucradas en el ensamblaje del PSI. En el primero de ellos se encontraron dos mutaciones puntuales localizadas en el intrón 1 que afectaron la eficiencia de "splicing" de este gen que se vio disminuida en función de la temperatura. Los resultados indican que el genotipo mutador estudiado es una fuente promisoria para el análisis funcional del plastoma.Chloroplasts are exclusive organelles of the plant cell. Photosynthesis, one of the major processes for life in Earth, is carried out within them. These organelles hold their own DNA or plastome which is cytoplasmically inherited and highly conserved. Natural variability of the plastome is hardly observed and the artificial induction of mutations has been very difficult to obtain. A barley chloroplast mutator gene was genetically characterized in the Institute of Genetics, which induces a wide spectrum of plastome mutations. In this thesis, three chloroplast mutants isolated from the mutator genotype, the cytoplasmic lines CL2, CL3 and CL9, were analyzed from physiological, biochemical and molecular approaches. In the case of CL2 mutant, an albo-viridis type, the results of pigment and chloroplast proteins determination in experiments of seed imbibitions with antibiotics that inhibit chloroplast translation, suggest that CL2 seedlings have a delay in chloroplast protein synthesis in the upper part of the first leaf blade. In the wild type barley, this process appears to take place before germination. The only plastome gene involved in the regulation of chloroplast translation is the infA gene, which was consequently postulated as a candidate gene for CL2 phenotype. After sequencing infA gene in CL2, a point mutation that changed an amino acid in IF1 (initiation factor 1) protein was found. It was concluded that CL2 is an infA gene mutant, being this the first time that a mutant phenotype is associated to this gene in higher plants. Furthermore, the CL2 phenotype was observed to be closely linked to mutations in infA gene, as was clearly demonstrated after isolation of new CL2-like mutants. In the case of CL3 mutant, a viridis and temperature-sensitive type, the chlorophyll and carotenoids composition was determined showing that CL3 has lower chlorophyll content than the wild type, especially at high temperature. The results of xanthophylls cycle pigment content pointed out that the mutant suffers from photo-oxidative stress. Furthermore, the chlorophyll fluorescence spectra at room temperature or at 77 K indicated photoinhibition and an affected photosystem I (PSI) in CL3. When the thylakoid proteins were analyzed, some PSI subunits were found to be decreased or absent in CL3 when the seedlings were grown under certain light and temperature conditions. Taking into account the above mentioned results, the loci ycf3 and ycf4, which encode two chaperones involved in PSI assembly, were postulated as candidate genes for CL3 phenotype. After sequencing both genes, two point mutations were found in intron 1 of ycf3, which showed to affect splicing depending on temperature. CL9 mutant, a virescent type, does not bear any conspicuous rearrangements or deletions in the plastome detectable by RFLP in the conditions assayed in this thesis. Postulations on possible candidate genes were not elaborated for this mutant and the molecular basis of the mutation remains to be established. The results indicate that the mutator genotype in study is a promising resource for the functional analysis of the plastome.Fil:Landau, Alejandra Mabel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina