Studies on the phosphorylation of the TGBp1 movement protein of Potato virus X

El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que la proteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente en extractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, que posee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en geles bidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentes puntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantas infectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación de estudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa, comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluación de la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1, se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N. tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en los residuos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de la proteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que una proteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1 durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo en que la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante la infección viral.Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is based on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movement proteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capside protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside the host plant. Recent work on other plant viruses has indicated that viral proteins phosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication and mobilization. The results obtained during this Thesis work show that TGBp1 is phosphorylated by at least one kinase protein with properties characteristic of Caseinkinase 2 (CK2). This kinase activity is present in crude extracts prepared from both non-infected and PVX infected Nicotiana tabacum plants. Bi-dimensional gel experiments with crude extracts from PVX infected plants showed that TGBp1 expressed during infection presented several isoforms with different Isoelectrical points. Some of these isoforms were sensitive to phosphatase treatment, suggesting that TGBp1 is phosphorylated in multiple residues. Several experimental approaches (mass spectrometer identification of phosphorylated aminoacids, sequence comparison among TGBp1 homologues from several viruses, and in vitro phosphorylation experiments with mutated versions of TGBp1), allowed the identification of three potential phosphorylation sites by recombinant alpha subunit N. tabacum CK2: S-165, T-193 and T-214. Mimicking phosphorylation on residues T-193 and T-214 had a negative impact on viral spreading and TGBp1 ATP hydrolysis activity. The results presented in this Thesis strongly suggest that a N. tabacum kinase protein belonging to CK2 family is involved in the phosphorylation of TGBp1 during PVX infection. How the phosphorylation regulates TGBp1 activities is discussed.Fil:Módena, Natalia A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina