Protein malnutrition as a model of perinatal adversity and its influence on the development of cognitive and socioemotional skills

El desarrollo perinatal representa un período crítico en la vida de un individuo caracterizado por una sensibilidad extrema a experiencias e interacciones con el medio ambiente que originan efectos duraderos, y muchas veces permanentes, sobre la estructura y función del cerebro. La calidad del período embrionario como la calidad del ambiente y experiencias postnatales tempranas tienen una enorme influencia sobre el desarrollo emocional y cognitivo con consecuencias que se extienden durante toda la vida. Una de las causas más difundidas entre la población mundial y con consecuencias más deletéreas sobre el desarrollo y la plasticidad neuronal es la que proviene de la desnutrición o la malnutrición. Esta provoca, según su severidad, desde problemas y retardos en el aprendizaje hasta retrasos mentales con profundas consecuencias en la sociabilidad del sujeto a lo largo de toda su vida. Los modelos en roedores han demostrado ser útiles ya que se observaron alteraciones neuroanatómicas comparables y deficiencias similares en las capacidades de aprendizaje y memoria(1). Estas evidencias convergentes sugieren una relación causal entre malnutrición proteica y alteraciones neurofisiológicas. Sin embargo, y pese a los avances realizados al respecto en los últimos años, diversos interrogantes permanecen aún sin respuesta. Algunas de estas cuestiones abiertas se refieren a cuales son las alteraciones conductuales y cognitivas afectadas por la malnutrición en la etapa perinatal, si las deficiencias observadas presentan dimorfismo sexual, cuáles son los mecanismos moleculares que median los efectos permanentes de la malnutrición en etapas tempranas de la vida y si los efectos observados son transmitidos a las siguientes generaciones que no hayan sido sometidas a esta adversidad perinatal. En este trabajo de tesis nos centramos en el establecimiento de un modelo de malnutrición proteica perinatal en ratones, estudiando el efecto sobre el comportamiento de las crías a diferentes edades, con el fin de dilucidar si las diferencias encontradas en la bibliografía se debían a la edad a la que se realizaron los estudios. Además se trabajó con crías machos y hembras con el objeto de identificar posibles efectos diferenciales de la dieta de acuerdo al sexo. Nuestra evaluación inicial del desarrollo morfológico y neurológico de las crías reveló un claro retraso en el grupo cuyas madres sufrieron una reducción del 55% en el contenido proteico de la dieta. Estas últimas sufrieron una alteración en su comportamiento tanto en lo referido al cuidado dedicado a las crías como en la presencia de un comportamiento de tipo ansioso. Este comportamiento de tipo ansioso también fue observado en las crías mediante los test de laberinto elevado en cruz y de campo abierto, junto con una menor motivación exploratoria revelada por el test de escape de la jaula. En relación a las capacidades cognitivas de las crías se encontró un defecto en la memoria declarativa de largo término y la memoria espacial de corto término solamente en machos. En hembras se evidenció además un mayor componente de comportamiento tipo depresivo, que no fue observado en machos. Con el fin de develar las bases moleculares de los defectos observados, realizamos un análisis de la expresión de génica y de los niveles de modificaciones epigenéticas, a diferentes edades en ambos sexos. Encontrando una disminución en la cantidad de mensajero de la neurotrofina BDNF y una acetilación diferencial global de las histonas 3 y 4. Este hallazgo resulta interesante debido a que está ampliamente documentado que BDNF es fundamental para el desarrollo del sistema nervioso y cumple diversos roles en procesos de aprendizaje y memoria. Además se ha visto que su expresión se encontraba disminuida en ratones que sufrieron de un estrés perinatal (como períodos de separación materna), y en modelos de enfermedades neurológicas y psiquiátricas. Por otro lado, la expresión de este gen es finamente regulada a través de diversas modificaciones epigenéticas por lo que es sensible a factores ambientales. En nuestro modelo, la acetilación anormal observada en ratones malnutridos perinatalmente podría producir un desbalance general en la expresión de diversos genes que podría llevar a una menor expresión de BDNF. Ambas alteraciones moleculares observadas podrían formar parte de los mecanismos moleculares causantes de las deficiencias cognitivas y conductuales observados. Finalmente, los diferentes niveles de acetilación observados, posibilitarían la herencia de las diferencias observadas a una generación sucesiva que nunca fue expuesta a este tipo de malnutrición. Un estudio preliminar realizado a partir de la descendencia de ratones que sufrieron de una malnutrición hipoproteica perinatal, mostró una tendencia hacia un retraso en el desarrollo de estas crías y a una alteración en la conducta motivacional, tal como se había visto en sus progenitores. En resumen, los resultados aquí presentados demostraron que una malnutrición materna durante una etapa perinatal afecta la maduración del sistema nervioso, provocando cambios que perduran a lo largo de la vida, más allá del tiempo de exposición a la dieta deficiente. Estos cambios se pueden observar a nivel molecular y en un amplio rango de comportamientos. Cabe destacar también que el trabajo de la presente tesis permitió establecer dicho modelo de estrés perinatal, el cual servirá de base para futuros estudios en el laboratorio y que podrá utilizarse para generar y responder numerosas preguntas.Perinatal development represents a critical period in the life of an individual. It is characterized by extreme sensitivity to experiences and environmental interactions which may cause lasting and often permanent changes in brain’s structure and function. The quality of the embryonic period as the quality of the environment and early postnatal experiences, have a huge influence on emotional and cognitive development with consequences that extend throughout life. A common cause of poor development that has deep deleterious effects on brain’s growth and plasticity is that which comes from under nutrition or malnutrition. This provokes from problems and delays in learning to mental retardation with profound consequences for the sociability of the subject throughout his life. Rodents have proven useful as a model as they mimic the neuroanatomical disturbances and the learning and memory deficiencies observed in humans. These multiple evidences point to a causal relationship between protein malnutrition and neurophysiological alterations. However, despite the progress made in recent years in this regard, many questions remain unanswered. Some of these open questions concern which are the behavioral and cognitive alterations affected by malnutrition in the perinatal period, if these deficiencies are sexually dimorphic, which are the molecular mechanisms that mediate the permanent effects of malnutrition in early stages of life and whether the observed effects are transmitted to subsequent generations that have not been subjected to perinatal adversity. During this thesis we focused on the establishment of a perinatal protein malnutrition (pregnancy and lactation) model in mice, and studied the effect on the offspring behavior at different ages, in order to determine whether the differences found in the literature were due to the age at which the studies were conducted. We analyzed male and female offspring in order to identify possible differential effects of diet according to sex. Our initial evaluation of the offspring morphological and neurological development revealed a clear delay in the group whose mothers experienced a 55% reduction in the protein content of the diet. The latter suffered an alteration in their behavior both in terms of the care dedicated to the pups and in the presence of an anxiety-like behaviour. This anxiety-like behaviour was also observed in the offspring through the elevated plus maze and open field tests, along with a smaller exploratory motivation revealed by the cage escape test. We also found a defect in long-term declarative memory and spatial short-term memory, restricted to male individuals of the offspring. There was also evidence of a depression-like behaviour restricted to females. In order to unravel the molecular basis of the defects observed we analyzed gene expression and epigenetic modifications levels at different ages in both sexes. We found reduced BDNF mRNA levels and a differential global acetylation of histones 3 and 4. This is an interesting finding because it has been extensively reported that BDNF is crucial for brain development and has different roles in memory and learning. A reduced expression of BDNF has also been described in mice that had suffered from maternal separation during lactation, and for several neurological and psychiatric diseases models. Furthermore, BDNF expression is tightly regulated by epigenetic modifications so it is sensitive to environmental factors. In our model, the abnormal acetylation observed in perinatally malnourished mice could produce an overall imbalance in the expression of various genes that could lead to a lower expression of BDNF. Together, these molecular alterations could be part of the molecular mechanisms causing the cognitive and behavioral deficits observed. Finally, the different levels of acetylation observed would enable the inheritance of the observed differences to a later generation that was never exposed to this type of malnutrition. A preliminary study from the offspring of mice who suffered perinatal lowprotein malnutrition, showed a trend towards a delay in the development of these offspring and an alteration in motivational behavior, as was seen in their parents. In summary, the results presented here demonstrate that the quality of maternal nutrition during the perinatal stage affect maturation of the nervous system and causes changes that persist throughout life, even long after the exposure to the poor diet. These changes can be observed at the molecular level and in a wide range of behaviors. It is also noteworthy that the work of this thesis allowed us to establish a model of perinatal stress, which will be the basis for future studies in the laboratory and can be used to generate and answer many questions.Fil:Belluscio, Laura María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina