Interactions of Tacaribe and Junin arenavirus with their host cells during early stage of infection

Los arenavirus son virus envueltos con genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación tiene polaridad bisentido. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra en el citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside se denomina NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP), los cuales conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación de los arenavirus Tacaribe (TCRV) y Junín (JUNV). Debido a que TCRV no utiliza el receptor de transferrina humano (hTfR) para entrar en las células, se utilizo un modelo de células que expresan diferencialmente el TfR y se analizaron las vías de entrada utilizadas por el virus. Para ello, se utilizaron inhibidores farmacológicos de las diferentes vías endocíticas (dependiente de clatrina, colesterol, dinamina, acidificación endosomal y macropinocitosis) y se confirmaron los resultados obtenidos utilizando construcciones dominantes negativas unidas a GFP de proteínas involucradas en cada una de ellas. Estos experimentos permitieron caracterizar que en aquellas líneas que no expresan el hTfR, la vía endocítica principal de entrada es la dependiente de clatrina, dinamina y acidificación endosomal mientras que en las células que si expresan dicho receptor, la vía principal es la macropinocitosis. La endocitosis del virus mediada por la unión a un receptor celular puede desencadenar diferentes señales intracelulares para beneficiarse de procesos celulares. En este trabajo estudiamos la participación de la autofagia durante la infección con JUNV en un modelo de células humanas. Se analizó la distribución de la proteína LC3 sobreexpresada (marcador de la vía de la autofagia), se utilizaron inhibidores farmacológicos y células con el gen Atg 5 mutado (esencial para la activación de la vía convencional de la autofagia). Los resultados obtenidos permitieron determinar que esta vía se activa desde el inicio de la infección y permanece activa hasta 24 hs post-infección. Los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de estos arenavirus, sino que además permite desarrollar nuevos blancos antivirales contra JUNV.Arenavirus are enveloped viruses with a segmented RNA genome which replication cycle has a bisense polarity. The entry into the target cell depends on a receptor mediated endocitosis and a subsequent fusion pH dependant. Once the nucleocapsid is in the cytoplasm, 5 structural proteins are expressed. The majority nucleocapsid associated protein it is called NP. From one glycoprotein precursor (GPC), two glycoproteins are obtained called GP1 and GP2 and the signal peptide (SP) which they shape the claviforme structures found in the viral envelope. In this work, interactions virus-host cells were studied, characterizing the roll of different cellular proteins in the early stage of the Tacaribe (TCRV) and Junin (JUNV) Areniavirus multiplication cycle. Since TCRV does not use the human transferrine receptor (hTfR) to enter the cells, a model with a differential expression of the TfR was used and the pathways used by the virus were analyzed. In order to do that, pharmacological inhibitors of the different endocytic pathways (dependent on clathrin, cholesterol, dinamin, endosomal acidification and macropinocytosis) were used and the results obtained were confirmed using dominant negative tagged GFP constructions involved in each one of them. These experiments allowed us to characterize that in those cells that do not express the hTfR, the main endocytic pathway used by TCRV is the one dependent on clathrin, dinamin and endosomal acidification, while in those cells expressing this receptor, the main pathway is de macropinocytosis. Receptor mediated endocytosis used by the virus can unleash different intracellular signals in order to exploit different cellular processes. In this work we studied the autophagy involvement during the infection in a human cell line model. The distribution of the protein LC3 overexpressed (an autophagic marker) was analyzed. Pharmacological inhibitors of this pathway and Atg 5 gen mutated cells (essential for the conventional autophagy activation) were also used. Results obtained allow us to determine that this pathway is activated from the early steps of infection and remains active up to 24 hs post-infection. The findings presented in this work not only provides basic knowledge about the initial steps of these arenavirus replication cycles, but also allows to develop new antiviral targets against JUNV.Fil:Suyay Roldán, Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina