Structural and conformational analysis of E6*I, an alternative splicing product derived from E6 HPV16 oncoprotein

Las proteínas E6 de papilomavirus humano de alto riesgo participan en la progresión tumoral, mayoritariamente por su habilidad de promover la degradación de p53. Los transcriptos de HPV muestran un patrón de procesamiento complejo, donde E6*I es el transcripto más abundante en HPV de alto riesgo, correspondiendo en secuencia de aminoácidos a los primeros 50 aminoácidos de E6. Actualmente, no hay información estructural o bioquímica de este polipéptido que contiene la mitad del primer motivo de unión a Zn de E6, debido a la dificultad de obtener una estructura compacta y monomérica en tan pequeño polipéptido. En este trabajo se muestra que E6*I de HPV16 puede plegarse en oligómeros con alto contenido de hélice-α o láminas-β a pH 7.5 y 5.0 respectivamente, en ausencia de Zn. Los oligómeros-β son altamente estables y no se ven afectados por la presencia de Zn, mientras que los oligómeros-α tienden rápidamente a agregar, evitando esto la presencia de Zn. Dos moléculas de E6*I unen una molécula de Zn, sugiriendo una coordinación tetraédrica de alta afinidad (KD < 10⁻¹² M), que resulta en un dímero de E6*I mediado por Zn con significativa estructura secundaria. Previamente se encontraron en el citosol de líneas celulares transformadas por HPV oligómeros endógenos de E6, y nosotros proponemos que las características determinantes de esta agregación se encuentran dentro de E6*I. Los efectos reportados de E6*I están asociados a la regulación negativa de la proteína E6, y la relación entre ambas especies modula la degradación de p53 y otras cascadas de señalización de apoptosis. En este trabajo, demostramos la interacción directa y específica entre las proteínas E6 y E6*I de HPV16. La abundancia en la célula de E6*I con una naturaleza “camaleón” correlaciona con la plasticidad para unir blancos celulares, y su destino está asociado a un balance entre los niveles de proteína, la disponibilidad de Zn, el potencial redox y la oligomerización. Este pequeño pero complejo polipéptido está asociado a un efecto más que a una función de un producto viral que, cuando se encuentra en altas concentraciones, puede directa o indirectamente afectar varios procesos celulares.High-risk human papillomavirus E6 participates in tumorigenic progression, mainly by its ability to promote p53 degradation. HPV transcripts show a complex splicing pattern, where E6*I is the most abundant transcript in high-risk HPV types, comprising the first 50 amino acids of E6. No structural or biochemical information of this polypeptide, which contains half of the first zinc binding motif of E6, is available, due to the difficulty to acquire a compact monomeric fold in such a small polypeptide. We show that HPV16-E6*I can fold into either a-helix or ß-sheet large oligomers at pH 7.5 and 5.0, respectively, in the absence of zinc. The ß-sheet oligomers are highly stable and unaffected by the presence of zinc, while the a-helix oligomers tend to rapidly form aggregates, prevented by the presence of the metal. Two E6*I molecules bind per atom of zinc, suggesting a tetrahedral, high affinity arrangement (KD< 10⁻¹² M), which results in a zinc mediated E6* dimer with significant secondary structure. Endogenous E6 oligomers were previously found in the cytosol of high-risk HPV transformed cell lines, and we propose that the oligomerization determinant resides within E6*I. E6*I effects were reported to counteract those of E6 in cells, and the ratio between these two species modulates p53 degradation and other apoptosis dependent signaling cascades. In the present work, we show a direct and specific interaction between HPV16 E6 and E6*I. A residue of an evolved splicing event related to regulation of oncogene expression in HPV or a splicing event resulting from the selection of a small deleterious viral polypeptide, the abundant existence of E6*I with a “chameleon” nature correlates with target plasticity, and its fate is linked to a balance between protein levels, zinc availability, redox potential, and oligomerization. In addition, the results presented here have strong implications for zinc binding sites in nascent polypeptides. This evolved promiscuous folder speaks of effect rather than function of a viral product that, when highly increased, can directly or indirectly affect various cellular processes leading to cell deregulation and tumorigenesis.Fil:Heer, Angeles. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina