Regulation of the expression and relevance of the arginine methyltransferase Prmt8

Las células madre embrionarias (ESCs) son células derivadas del macizo celular interno (ICM) del blastocisto. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo y de dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocida como pluripotencia. Existen tres factores de transcripción fundamentales para la regulación génica de las células madre pluripotentes, Oct4, SOX2 y Nanog. Estudios de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) han revelado que estos factores ocupan al mismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo el genoma, sugiriendo que estos factores actúan como el núcleo de una red regulatoria que modula la expresión de genes involucrados en la diferenciación celular. Mientras que in vitro las ESCs pueden ser mantenidas indefinidamente en estado indiferenciado, in vivo, conforme progresa el desarrollo, las células del ICM abandonan su estado pluripotente para seguir diversos programas de diferenciación. El inicio de dichos programas depende, en gran medida, de la regulación de la expresión de genes tejidoespecíficos. Sin embargo, entender cuáles son estos genes y cómo son regulados no es suficiente para explicar el comienzo del proceso de diferenciación celular. Existen además, cambios en la organización de la cromatina a nivel global y de loci específicos, registrándose múltiples evidencias que relacionan la estructura de la cromatina de los genes marcadores de estadio indiferenciado con el mantenimiento de la pluripotencia. Nuestra hipótesis postula que existiría una relación bidireccional entre los niveles y la actividad de proteínas que remodelan la cromatina y de los factores de transcripción críticos en el mantenimiento de las propiedades de las células pluripotentes. El objetivo general de este trabajo es contribuir al esclarecimiento de la regulación epigenética que ocurre en las ESCs durante la diferenciación y el estado epigenético de éstas cuando son mantenidas en estado indiferenciado. Para ello, nos propusimos, en primer lugar analizar el patrón de expresión de proteínas modificadoras de la cromatina en ESCs indiferenciadas y en distintos estadios de diferenciación. Luego, una vez detectados genes de interés,evaluar el efecto de la modificación de sus niveles de expresión sobre el mantenimiento del estado indiferenciado y en la diferenciación de las ESCs. Por último, nos propusimos estudiar si los factores de transcripción relevantes en la preservación de la pluripotencia regulan la expresión los genes en estudio. Para nuestro primer objetivo, analizamos la expresión de enzimas relacionadas con el remodelado de la cromatina mediante RT-qPCR en ESCs indiferenciadas y las comparamos con la de células terminalmente diferenciadas. Posteriormente, diferenciamos ESCs mediante un protocolo no dirigido y analizamos la expresión de estos genes lo largo del proceso de diferenciación. Esta búsqueda arrojó una serie de genes candidato que podrían tener un rol en el mantenimiento de las propiedades básicas de las ESCs. Posteriormente, elegimos uno de estos genes, la metiltransferasa Prmt8, para continuar nuestros estudios. Los otros genes que surgieron de este análisis forman parte de otros proyectos de tesis. Utilizando tanto un protocolo de diferenciación no dirigido como uno dirigido hacia linaje neural, comprobamos que el gen de Prmt8 se regula negativamente durante el proceso de diferenciación. Por otra parte, construimos una línea estable de mESCs que contiene en su genoma un shRNA inducible contra Prmt8. Probamos que al inducir este shRNA los niveles de mensajero de esta enzima disminuyen, y que esto en un principio no afecta la capacidad de autorenovación de las células. Mediante análisis de inmunofluorescencia estudiamos la presencia y localización de marcadores del estado indiferenciado. No encontramos diferencias sustanciales en los marcadores analizados al comparar las células cultivadas en presencia del inductor del shRNA con las células control. Por otro lado, diferenciamos la línea que sub-expresa Prmt8 y encontramos que estas células parecen diferenciarse de forma diferente al control. Por último, analizamos si la expresión forzada de los factores de transcripción de pluripotencia modula la expresión de Prmt8 en un sistema heterólogo. En conjunto los datos sugieren que Prmt8 es regulado positivamente por los factores de transcripción de pluripotencia, y modulado durante la diferenciación, hecho que podría ser clave en la determinación del tipo celular de destino. En el futuro planeamos realizar estudios de inmunoprecipitación de la cromatina para estudiar la interacción de estos factores con el promotor de Prmt8. Por otra parte, nos interesa estudiar con mayor profundidad si la presencia de esta metiltransferasa es vital para la diferenciación hacia algún tipo celular en particular. Creemos que los conocimientos generados en el campo de la epigenética de células madre pueden contribuir a plantear estrategias que ayuden, en un futuro, a diseñar nuevas terapias celulares.Embryonic stem cells (ESCs) are cells derived from the inner cell mass (ICM) of the blastocyst. They have the ability to self-renew indefinitely in culture and to give rise to cells of all three germ layers, property known as pluripotency. There are three basic transcription factors that regulate gene pluripotent stem cells, Oct4, Sox2 and Nanog. Studies using chromatin immunoprecipitation (ChIP) have shown that these factors are simultaneously recruited to promoter regions of various genes throughout the genome, suggesting that these factors act as a core regulatory network that modulates the expression of genes involved in cell differentiation. While ESCs can be maintained in vitro in the undifferentiated state indefinitely, in vivo, as development progresses, ICM cells leave their pluripotent state to follow various programs of differentiation. The beginning of such programs depends largely on the regulation of expression of tissue-specific genes. However, understanding who these genes are and how they are regulated is not enough to explain the beginning of the process of cell differentiation. There also changes in global chromatin organization and in specific loci, registering evidence that link the chromatin structure of marker genes of the undifferentiated stage with the maintenance of pluripotency. Our hypothesis is that there is a bidirectional connection between the levels and the activity of chromatin remodeling proteins and transcription factors that are critical for the maintenance of pluripotent cell properties. The overall objective of this work is to contribute to the elucidation of epigenetic regulation that occurs in ESCs during differentiation and the epigenetic state of these when maintained in an undifferentiated state. For this purpose, we sought, first to analyze the expression pattern of chromatin modifying proteins in undifferentiated ESCs and at different stages of differentiation. Then, once detected genes of interest, we will assess the effect of changing their expression levels on the maintenance of the undifferentiated state and in the differentiation of ESCs. Finally, we decided to study whether the relevant pluripotency core transcription factors regulate the expression of the studied genes. For our first objective, we analyzed the expression of the enzymes involved in chromatin remodeling by RT-qPCR in undifferentiated ESCs and compared it with that of terminally differentiated cells. Subsequently, using the hanging drop differentiation protocol we analyzed the expression of these genes during the differentiation process. This search yielded a number of candidate genes that may play a role in maintaining the basic properties of ESCs. Then, we chose one of these genes, the methyltransferase Prmt8 to continue our studies. The other genes that emerged from this analysis are part of other thesis projects. Utilizing both an undirected differentiation protocol as well as one directed towards neural lineage, we found that the Prmt8 gene is negatively regulated during the differentiation process. Furthermore, we constructed a mESCs stable line containing in its genome an inducible shRNA against Prmt8. We prove that this shRNA inducing messenger levels of this enzyme decreases, and this does not affect the ability of self-renewing cells. By immunofluorescence analysis we studied the presence and location of the undifferentiated state markers. No substantial differences were found when comparing the analyzed markers cells cultured in the presence of inducer of control cells shRNA. Furthermore, differentiate the sub-express line Prmt8 and found that these cells appear to differ from the control differently. Finally, we examined whether forced expression of transcription factors modulates expression of pluripotency Prmt8 in a heterologous system. Taken together these data suggest that Prmt8 is positively regulated by the transcription factors of pluripotency, and modulated during differentiation, which could play a key role in determining the target cell type. In the future we plan to study the interaction of these factors with the promoter Prmt8. Moreover, we want to explore further whether the presence of this methyltransferase is vital for differentiation into a particular cell type. We believe that the knowledge generated in the field of stem cell epigenetics can help create strategies that help in the future, to design new cell therapies.Fil:Luzzani, Carlos Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina