Molecular characterization of a Trypanosoma cruzi flagellar calcium-binding protein encoding-gene, highly conserved among Trypanosomatides

La fracción flagelar de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, enriquecida en flagelos y elementos de membrana, ha mostrado en modelos experimentales murinos las mejores propiedades inmunogénicas, protectivas y no agresivas contra el desafío con el T. cruzi Quizás sólo un pequeño número de los componentes de esta fracción están involucrados en esta inmunidad protectiva en el huésped, en tanto que el resto de ellos podrían actuar en otros procesos esenciales para el parásito. Las señales de calcio juegan un papel preponderante en diversos mecanismos de transducción de señales en parásitos, tanto en relación a la invasión a la célula hospedadora como en los cambios morfo-fisiológicos del mismo a lo largo de su ciclo de vida. Asimismo, la alta conservación de las proteínas moduladoras de calcio en distintos tripanosomátidos, ha sugerido su posible implicancia en dichos procesos de transducción. En este trabajo se describe la caracterización a nivel molecular del gen que codifica para una proteína flagelar ligadora de calcio en T. cruzi, y su versión homóloga en Trypanosoma rangeli. Varios clones de ADN recombinante fueron detectados en una genoteca de expresión construida a partir del ADN total de la forma epimastigote de T. cruzi (clon Miranda/76), en el vector de expresión λgt11 , utilizando suero de conejo anti-fracción flagelar. Dos de esos clones recombinantes fueron seleccionados para la caracterización de sus productos de expresión. La expresión de estos clones recombinantes en bacterias produjo proteínas fusionadas a la enzima g-galactosidasa, las que mostraron poseer epitopes reconocidos por anticuerpos dirigidos contra la fracción flagelar del parásito. La adsorción del suero anti-fracción flagelar por las proteínas expresadas, permitió obtener anticuerpos que identificaron por "inmunoblotting" moléculas de 29 kDa en ambos casos, en homogeneizado total de epimastigotes y fracción flagelar, mientras no reaccionaron con antígenos de Leishmania brasiliensis. Posteriormente, el análisis de la secuencia de bases de ambos fragrnentos confirmaron que los insertos provenientes de ambos clones codifican para una misma proteína de 29 kDa. en T. cruzi. La presencia de este antígeno F29 en la superficie del parásito fue comprobada por inmunofluorescencia. La expresión del gen completo que codifica para la proteína flagelar F29 en el vector pMAL-p2 permitió obtener una proteína recombinante fusionada a proteína de unión a maltosa, que mostró ser ligadora de calcio. Cuando se ensayó la inmunogenicidad del antígeno recombinante F29-MBP, utilizando Bordetella pertussiscomo adyuvante, se observó que esta proteína es capaz de generar una respuesta inmune humoral contra el T. cruzi, demostrada por anticuerpos dirigidos contra la proteína pura y el homogenato total del parásito. Los epitopes generadores de respuesta en F29-MBP fueron reconocidos en un gran número de otras proteínas en el parásito, a igual que se mostraron altamente representados en el T. rangeli. El gen que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca++ F29 mostró encontrarse organizado en al menos 20 copias, altamente conservadas entre cepas pertenecientes a distintos zimodemas, adyacentes una a la otra con una disposición cabeza-cola en el genoma del parásito. Dicho gen se expresa en epimastigotes de T. cruzi transcribiendose a un mensajero policistrónico, el cual podría sufrir un procesamiento post-transcripcional de clivaje y poliadenilación, también observado para otros genes del parásito. El perfil encontrado para diferentes clones y cepas de T. cruzi estudiados por hibridización a cromosomas enteros fraccionados por electroforesis en campo pulsado reveló que el gen que codifica para la proteina flagelar F29 se halla ampliamente representado en T cruzi, mostrando una conservación intraspecífica en las cepas y clones evaluados. Asimismo, estos patrones de hibridización mostraron una alta correlación con la clasificación isoenzimática de las distintas cepas y clones analizadas de acuerdo a su perfil isoenzimático basado en 2, 12, 13 y 19 loci. A su vez, la existencia de al menos dos arreglos de repeticiones de genes, ubicados en un par de cromosomas homólogos fue observada al enfrentar la misma sonda a productos de digestión provenientes de la digestión de cromosomas enteros de distintas cepas, con enzimas sin sitios de corte dentro del inserto. La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa sobre ADN genómico total de T. rangeli (aislado LDG) usando como iniciadores de la síntesis oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia completa del gen que codifica en T cruzi para la proteína flagelar ligadora de calcio F29, permitió la obtención de un fragmento de ADN que codifica para una proteína de 23 kDa con alta homología con proteínas flagelares responsables de la unión a Ca2+ en otros tripanosomátidos. La hibridación a ARN de T. rangeli reveló que esta proteína se expresa como un transcripto poliadenilado de 1.6 kb, a raiz, al igual que en T. cruzi, de un procesamiento post-transcripcional. El gen que codifica para TrCaBP en T. rangeli tambien se encontró organizado en al menos 20 copias por célula, en dos cromosomas de gran tamaño en ciertos aislados del T. rangeli, y a dos pequeños en otros aislados. Los resultados presentados demuestran que la información genética que codifica para la proteína flagelar ligadora de Ca2+ F29 del T. cruzi se encuentra altamente conservada en el genoma de otros tripanosomátidos, sin encontrarse presente en el género Leishmania.The flagellar fraction of Trypanosoma cruzi epimastigotes contains flagellar membrane components such as glycoproteins and parasite surface enzymes. This fraction has the best immunoprotective properties in the murine model. Just a few of these components would be involved in this protective response, whereas others would play a key role in parasite's essential processes. Calcium signals would play an important regulatory role in signal transduction processes in parasites, being critically involved in the coordination of life cycle events and cell invasion. Likewise, the high conservation of calcium-modulated proteins among different trypanosomatides supports the notion that these cell-surface calflagins would play common roles in these caZ+-transduction processes. In the present study, we report the cloning and molecular characterisation of genes encoding EF-hand calcium-binding proteins in Trypanosoma rangeli and T. cruzi, showing that these genes are highly conserved in these related trypanosomes. A T. cruzi, Miranda/76 clone, genomic Agtl 1 expression library was screened with rabbit anti flagellar fraction polyclonal antibodies and several clones were obtained. Two of them, with inserts of 550 and 750 bp respectively, were selected for recombinant protein production. The IS-galactosidase fusion proteins produced in bacteria by IPTG induction possesed epitopes recognized by antibodies raised against T. cruzi flagellar fraction. Antibodies selected from the anti-flagellar fraction polyclonal sera using these fusion proteins, detected a 29 kDa. protein in T. cruzi epimastigote whole homogenate and flagellar fraction by immunoblotting, whereas no reactivity was observed against Leishmania brasiliensis . Subsequently sequence analysis showed that both inserts encoded for the same 29 kDa. protein in T. cruzi. The presence of F29 antigen on the parasite surface was confirmed by indirect immunofluoresence. Expression of the complete F29 encoded-gene into pMAL-p2 expression vector showed that F29 is a calcium-binding protein. Furthermore, this recombinant protein was inmunogenic in mice, using Bordeteila pertussis as adyuvant. Antibodies raised against F29recognized several proteins in T. cruzi by immunobloting as well as in T. rangeli. F29 is encoded by at least twenty tandemly arranged highly conserved genes, organized in a head-to-tail fashion in the parasite genome. F29-encoding gene is transcribed as a polyadenylated transcript in the parasite. PFGE hybridization experiments revealed the presence of the F29 genes in different T. cruzi isolates, cloned stocks and strains, with common features between T. cruzi isoenzimatic classification and chromosomal hybridization patterns. Similar pattern of one or two bands were seen after PFGE-Southern analysis with rare cutting restriction enzymes, which do not cut inside the tandem array, indicating a disomic chromosomal constitution for F29 genes. PCR amplification of T. rangeli genomic DNA, using primers derived from the T. cruzi F29-encoding sequence made it possible to isolate the homologous gene in T. rangeli, encoding a 23 kDa highly homologous to calcium-binding proteins from trypanosomatids. Northern blot analysis revealed that the Tr CaBP gene is also expressed in T. rangeli as a polyadenylated transcript. The TrCaBP-encoding genes are present in at least 20 copies per cell, organized in tandem arrays on large T. rangeli chromosomes in some isolates, and on two smaller in others. Hence, the calcium-modulated proteins encoding genes, as well as their genomic organization, are well conserved in trypanosomes. The gene, however, seems to be absent from Leishmania sp.Fil:Porcel, Betina Mabel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina