Optimization of the expression of a PVX-based viral amplicon in tobacco plants. Functional characterization of the 15 kDa protein from Garlic mite-borne filamentous virus

Con el objetivo de optimizar la producción de proteínas heterólogas en plantas se desarrolló un sistema de expresión basado en un amplicón derivado del genoma del PVX. Se diseñaron distintos amplicones virales que permiten la expresión, tanto constitutiva como inducible, de proteínas recombinantes. La utilización del amplicón constitutivo permitió obtener, por primera vez, plantas transgénicas que sobrexpresan altos niveles de proteínas virales. Además, se logró expresar exitosamente GFP a partir de un amplicón inducible, tanto en ensayos de expresión transitoria como en plantas transgénicas. Uno de los problemas que dificultan la producción de proteínas de interés en plantas utilizando vectores virales es el establecimiento de respuestas de silenciamiento génico postraduccional (PTGS) en respuesta a la replicación viral. Para intentar superar esta dificultad, se propuso co-expresar un amplicón viral junto con una proteína supresora del PTGS. Se caracterizó la actividad de una nueva proteína supresora del PTGS, la proteína 15K codificada en el genoma del Garlic mite-borne filamentous virus (GmbFV). Si bien esta proteína muestra una actividad supresora débil en plantas silenciadas por agroinfiltración con transgenes u horquillas de silenciamiento, presenta la ventaja de no producir fenotipos aberrantes en plantas transgénicas. Mediante la co-agroinfiltración con construcciones que expresan la proteína 15K y el amplicón PVX-2aA (amplicón que expresa el epítope 2aA del virus de aftosa) se lograron obtener altos niveles de una fusión del epítope de interés a la cápside viral en plantas de Nicotiana benthamiana en un corto período de tiempo. Este resultado sugiere que es posible generar sistemas estables que permitan obtener altos niveles de expresión mediante el cruzamiento entre plantas transgénicas que expresen la proteína supresora 15K y amplicones de interés.In order to optimize the production of heterologous proteins in plants, an expression system based on the PVX genome has been developed. Several viral amplicons have been designed with the purpose of expressing recombinant proteins, either constitutively or in an inducible manner. The use of constitutive amplicons led, for the first time, to the generation of transgenic plants which over-express high levels of viral proteins. Moreover, GFP protein was successfully expressed from an inducible amplicon, both in transient expression assays and in transgenic plants. One of the problems that hinder the production of heterologous proteins using plant viral vectors is the establishment of post-transcriptional gene silencing (PTGS) in response to viral replication. In an attempt to overcome this restriction, the co-expression of PTGS- suppressor proteins and viral amplicons was explored. The 15K protein of Garlic mite-borne filamentous virus (GmbFV) has been characterized as a new PTGS-suppressor. Although this protein shows suppressor activity in agroinfiltration assays triggered by both transgenes or silencing hairpins, it has the advantage of avoiding the development of aberrant phenotypes in transformed plants. Co-agroinfiltration of the 15K protein and the PVX-2aA amplicon (harbouring the 2aA epitope of Foot and mouth disease virus) yielded high levels of a fusion comprising the epitope of interest and the PVX coat protein in N. benthamiana. This result suggest that stable expression systems could be developed by crossing of transgenic plants carrying the 15K suppressor protein and plant viral amplicons.Fil:Bey, Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina