Neuroprotective action of erythropoietin in in vitro models

La supervivencia de las células neuronales depende de un estricto balance entre diversos factores pro y antiapoptóticos. La pérdida de este delicado equilibrio puede conducir a la muerte celular por apoptosis como se manifiesta en accidentes cerebro-vasculares y en enfermedades neurodegenerativas. La muerte neuronal puede ocurrir en forma directa, donde el daño per sé induce la disminución del número de células viables o bien indirectamente, involucrando la activación de células de la glía, las cuales liberan citoquinas proinflamatorias, nitritos y especies reactivas del oxigeno, agentes causantes de la degeneración neuronal. La deficiencia de oxígeno (hipoxia) en el sistema nervioso central es un factor de estrés que induce múltiples respuestas. A nivel celular, la exposición a hipoxia puede inducir una desregulación metabólica con pérdida de la homeostasis y muerte celular. Además, durante dicho proceso se desarrolla un microambiente proinflamatorio generado por la activación de la glía, lo cual afecta indirectamente a las células neuronales. Dado el impacto de las secuelas que pueden originarse, se desarrollaron diferentes líneas de investigación con el fin de prevenir el daño neuronal y sus consecuencias. La eritropoyetina (Epo) es una citoquina pleiotrópica, originalmente definida por su rol en la eritropoyesis. Sin embargo, el hallazgo de receptores específicos en tejidos no hematopoyéticos, expandió su acción biológica y farmacológica. La utilización potencial de los efectos no hematopoyéticos de la eritropoyetina recombinante es uno de los aspectos más promisorios en la investigación de la acción farmacológica de esta hormona. De hecho, la Epo ha sido asociada a la prevención de apoptosis de células neuronales sometidas a agresiones tales como privación de nutrientes o factores de crecimiento. Si bien se propone a la Epo como factor de protección celular frente a estímulos apoptóticos, poco se sabe acerca de la modulación de su acción en diferentes estadios de diferenciación neuronal. Por otro lado, resultados de investigaciones utilizando diversos modelos experimentales le han adjudicado a la Epo una acción antiinflamatoria, aunque aún se desconoce el rol que puede presentar este factor sobre la microglía ante un daño tisular. En este trabajo se planteó, como objetivo general, el estudio del efecto modulador y/o neuroprotector de la Epo frente a daños inducidos por hipoxia y por otros estímulos. Para el estudio de la acción antiapoptótica de Epo frente al daño por hipoxia se utilizó un modelo in vitro de cultivos de la línea de origen neuronal SH-SY5Y. Además de disminución de la viabilidad celular y aumento significativo de la apoptosis, la exposición a hipoxia indujo alteraciones morfológicas tales como disminución del área celular y pérdida de la adhesión celular en cultivos indiferenciados. Como resultado del pretratamiento de estos cultivos con Epo, fueron prevenidos los efectos de la posterior exposición a hipoxia. En esta acción antiapoptótica de la Epo se encontraron involucrados la vía mediada por PI3K y el incremento de los niveles de los factores antiapoptóticos Bcl- 2 y Bcl-xL. Actualmente, se reconoce que los mecanismos de muerte celular son marcadamente diferentes en el cerebro inmaduro y en desarrollo por lo que, en el siguiente paso de este trabajo se realizó una comparación de la acción de Epo entre estadios inmaduro y maduro de células de origen neuronal. Los resultados obtenidos sugieren que la diferenciación celular, mediada por el agente diferenciador ácido retinoico (atRA), aumenta el umbral de resistencia celular ante diferentes agentes proapoptóticos, como staurosporina (STP), TNF-α o hipoxia. Este hallazgo se encontró asociado a la activación de la vía de supervivencia celular PI3K y a una regulación positiva del factor antiapoptótico Bcl-2, lo que explicaría, al menos parcialmente, la disminución de la susceptibilidad celular. En los cultivos de células neuronales diferenciadas con atRA no se pudo detectar un efecto protector de la Epo frente a la exposición a STP. Esta observación coincidió, a su vez, con la ausencia de modulación de los factores Bcl-2 y Bcl-xL por Epo. Además, la acción de Epo fue afectada por la modulación negativa de la expresión de su receptor observada en los cultivos diferenciados por atRA. Como se mencionó anteriormente, la inflamación se encuentra involucrada de manera crónica en enfermedades neurodegenerativas como también en procesos de isquemia cerebral y es una de las principales causas de muerte neuronal. En base a trabajos previos en los que se reportó un efecto antiinflamatorio de la Epo en distintos tejidos, se investigó si la Epo podía presentar un efecto modulador en cultivos de células de microglía murina EOC-2 activados por hipoxia química y se estudió el comportamiento de la hormona frente a estímulos proinflamatorios. No se observó un efecto antiinflamatorio clásico de Epo frente al estímulo de hipoxia química. Sin embargo, los resultados mostraron una acción directa de la Epo sobre la microglía incrementando los niveles de iNOS, enzima responsable de la síntesis de óxido nítrico. Además, la Epo mostró acción antioxidante previniendo la formación de especies reactivas de oxígeno e impidió la proliferación de las células de microglía inducida por hipoxia química en ausencia de Epo. Estos hallazgos sugieren que si bien la Epo no impide la activación de la microglía, podría reducir el daño potencial implicado, contrarrestando la inflamación a largo plazo mediante una acción antioxidante y antiproliferativa. En base a los resultados obtenidos, resultó interesante investigar la acción de la Epo en modelos de interacción microglía-neurona. Se observó el efecto neuroprotector de Epo ante la exposición de cultivos de células neuronales SH-SY5Y a medios condicionados obtenidos en cultivos de microglia estimulados por hipoxia. Esta acción citoprotectora de Epo también fue observada en cultivos de las células neuronales expuestas a medios condicionados de cultivos de macrófagos (células RAW) estimulados con LPS-IFNγ. Los resultados obtenidos en este trabajo aportan nuevos conocimientos sobre la acción de la Epo sobre células neuronales y de microglia. Por un lado, la Epo presenta acción neuroprotectora ante el daño directo inducido en células indiferenciadas por diversos agentes proapoptóticos como también ante un ambiente proinflamatorio inducido por la activación, tanto de células de microglía como de macrófagos. Si bien la Epo no presentó una acción antiinflamatoria clásica sobre la microglia, sí mostró un efecto antioxidante y antiproliferativo. De esta manera, se podría sugerir que la acción de la Epo atenuaría la activación de la microglía y, de esta forma, contribuiría a prevenir el desarrollo de un cuadro proinflamatorio mayor, disminuyendo el riesgo de la aparición de efectos perjudiciales para el sistema nervioso. Dada la búsqueda constante de nuevos fármacos para el tratamiento de enfermedades neurodegerativas y la existencia de la eritropoyetina recombinante humana, el conocimiento de la acción antiapoptótica y moduladora de dicha hormona sobre células del sistema nervioso puede constituir un aporte importante a sus características terapéuticas ya conocidas.Among the factors that support cell survival, erythropoietin (Epo) is well known as a growth factor that maintains the number of circulating erythrocytes primarily by preventing apoptosis of erythroid progenitors. However, its biological role has been expanded by the finding of specific receptors in non-hematopoietic tissues, such as endothelial and neuronal tissues. Evidence has shown that Epo exhibits neuroprotective effects in vitro against proapoptotic agents. In addition, in vivo studies in adult and neonatal animal models have revealed a neuroprotective action of exogenous Epo administration. In this work, we compared the protective action of Epo between immature and mature cultures of neuroblastoma cells. We found a neuroprotective action of Epo upon undifferentiated neuronal SH-SY5Y cells against cytotoxicity induced by staurosporine (STP), TNF-alpha or hypoxia. Our results suggest that Epo might repress neuronal apoptosis by activation of PI3K and JAK-2 signaling pathways upregulating the expression of the antiapoptotic factors Bcl-2 and Bcl-xL. On the other hand, SH-SY5Y cell differentiation by retinoic acid (atRA) caused cell resistance to the Epo action. Together, the results describing modulation of the signaling pathways activated by Epo and those observed in cultures with atRA suggest that differentiated cell resistance to Epo protection can be coupled to an altered response at the EpoR level. During cerebral ischemia, hypoxia may not only cause neuronal cell injury in a direct way, since neuron-microglia interactions are important for neuronal viability. In vitro and in vivo studies have shown that hypoxia can activate microglia cells, leading to proinflammatory reactions that contribute to create a stressing environment upon neighboring neurons. Because of the role of hypoxia in proinflammatory mechanisms in the nervous system, and the protective effect of Epo against a proinflammatory condition resembled by TNF-α, we investigated the role of the hormone in the dialogue between neuron and microglial cells. As the first line of defense, microglia play a critical role in the innate immune response of the central nervous system (CNS) but an excessive response to CNS injury induces microglial activation. Thus, it is likely that toxic inflammatory mediators produced by activated microglial cells under hypoxic conditions may exacerbate neuronal injury following cerebral ischemia. The next step in the current research was the characterization of microglia activation. The murine EOC-2 cell line activated by chemical hypoxia induced by CoCl2 showed increased proinflammatory mediators (nitrites and TNF-α), reactive oxygen species (ROS), iNOS and Cox-2 modulation while cell proliferation data and PCNA stain demonstrated the mitogenic effect of chemical hypoxia. Pretreatment with Epo prevented the CoCl2 effect on cell proliferation and oxidative stress without changing nitrite production, iNOS protein expression or TNF-α secretion. Finally and taking into consideration the results obtained, it was interesting to investigate the effect of hypoxia upon the dialogue microglia-neuron. Conditioned media from activated microglial cells induced apoptosis of SH-SY5Y neuronal cells, effect that was abolished by Epo. Neuroprotection by this cytokine was also demonstrated against the cytotoxic effect of conditioned media obtained from activated macrophages (RAW 264.7 cell line). These results show that even though Epo did not exert a direct antiinflammatory effect upon microglial activation it did increase the resistance of neurons to subsequent damage derived from a proinflammatory environment. In conclusion, our results suggest that Epo protects neuronal cells from direct injuries as well as from the indirect damage caused by cytotoxic agents produced from microglia activation. The demonstrated antioxidant and antiapoptotic ability of Epo could contribute to consider this agent as a neuroprotective factor.Fil:Wenker, Shirley Denise. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina