Study of the interactions between phospholipids and integral membrane proteins. Effects on the enzymatic activity of a Ca2+ transport ATPase

Las membranas celulares son estructuras dinámicas complejas de composición bioquímica muy diversa. Las interacciones específicas lípidolípido y lípido-proteína pueden generar dominios estables o transientes de composición y función biológica diferenciales. En este trabajo, abordamos el estudio de la regulación de la actividad de una proteína integral de membrana, la bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) por anfifilos que integran el sistema en el cual se la reconstituye. En micelas de lípidos y detergente, pudimos verificar que la actividad depende de la proporción relativa de estas especies y postulamos un modelo que explica esta dependencia en base al intercambio de anfifilos a nivel del dominio transmembrana. El análisis realizado con diversos métodos espectroscópicos mostró que los cambios estructurales asociados a la activación por lípidos serían sutiles pero suficientes para transducir una señal de activación al dominio citoplasmático de PMCA. Utilizando espectroscopía de correlación de fluorescencia y la sonda fluorescente Laurdan observamos que la actividad depende además de la fluidez del entorno y del tamaño de las micelas. Para extender este estudio al entorno natural de las proteínas -la membrana celular- evaluamos diversas sondas fluorescentes y pudimos determinar que la sonda C-Laurdan permite estudiar por microscopía confocal la organización de membranas biológicas.Cellular membranes are dynamic complex structures with a highly diverse biochemical composition. Specific lipid-lipid and lipid-protein interactions can generate transient or stable domains of particular composition and biological function. In this work, we study the regulation of the activity of an integral membrane protein, the plasma membrane calcium pump (PMCA), by phospholipids that make up the reconstitution system. Working in a mixed micelles lipid/detergent system, we verify that the activity depends on the relative proportion of these species and we posited a model that explains this relationship by the exchange between amphiphiles at the protein transmembrane domain. The analysis performed by spectroscopic methods showed that the structural changes associated with the activation by lipids are subtle but enough to transduce an activation signal to the cytoplasmic domain of PMCA. Using fluorescence correlation spectroscopy and the fluorescent probe Laurdan, we observed that the activity is also related to micelle size and the fluidity of the protein lipidic microenvironment. To extend this study to the natural environment of the protein –the cellular membrane- we assayed the performance of several fluorescent probes and we could determine that the probe CLaurdan allows studying the organization of biological membranes by confocal microscopy.Fil:Dodes Traian, Martín Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina