Identification and characterization of a Type I secretion system in Agrobacterium tumefaciens

Los Sistemas de Secreción de Proteínas tipo I (T1SS) permiten a una amplia variedad de bacterias Gram-negativas secretar proteínas al medio extracelular; estos sistemas participan en varias respuestas fisiológicas como la adaptación al medio ambiente y contribuyen a la virulencia en diversos patógenos. Los T1SS están formados por un componente de membrana interna (ABC) un componente de fusión de membrana (MFP) y un componente de membrana externa (OMF). Los genes de los dos primeros (e inclusive el OMP) suelen estar formando un operón y pueden estar adyacentes a los genes que codifican sus proteínas sustrato. En la bacteria simbionte Rhizobium leguminosarum, el T1SS, PrsDE, es responsable de la secreción de diversas proteínas que participan en la supervivencia del rizobio en el suelo, favoreciendo la formación de estructuras comunitarias denominadas biofilms. A. tumefaciens es un fitopatógeno de alto interés agronómico y biotecnológico. A pesar de la relevancia que los TISS muestran tener en diversas bacterias Gram negativas, hasta la fecha no se ha avanzado en el estudio y la relevancia fisiológica de estos sistemas de secreción en este fitopatógeno. En este trabajo, se aisló a partir de una biblioteca genómica proveniente de A. tumefaciens el cósmido pIJ7760 que fue capaz complementar el fenotipo de secreción de cepas mutantes en el sistema PrsDE de R. leguminosarum. Se determinó que dicho cósmido alberga los genes de un sistema homólogo al que se denominó AspD-AspE, Agrobacterium secretion protein D and E) formado por un componente ABC (dominio de unión a ATP) y otro MFP (proteína de fusión de membranas), respectivamente. Este sistema fue responsable de la secreción de una proteína, a la que se denominó Hla, de función desconocida codificada rio arriba de aspDE. El análisis de las secuencias del cósmido permitió identificar, río arriba de hla, genes cuyo productos presentan alta similitud de secuencia aminoacídica con receptores de hemo (denominado hlaR) y a factores sigma y anti sigma (denominados hlaS y hlaI). Las zonas promotoras de ambos loci presentaron secuencias consenso de reconocimiento del regulador RirA que responde a la concentración de hierro extracelular. Rio arriba de estos genes se identificó un probable sistema ABC de captación de hemo (denominado ahuUVTB) que presenta en su región promotora secuencias de reconocimiento de RirA y del regulador del metabolismo del hemo IrrA. El análisis de las proteínas presentes en el medio extracelular en diversas condiciones de cultivo y nutricionales permitió reflejar un complejo control y una regulación diferencial de la secreción de la proteína Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 y A. tumefaciens C58. Se observó una muy elevada secreción de Hla en el hospedador sustituto R. leguminosarum A34 en medios ricos de cultivo. Se determinó que esta desregulación se debe a que la cepa de A34 contiene una mutación ancestral en algún regulador desconocido hasta la fecha que provoca un fenotipo pleiotrópico. Este regulador es codificado en el plásmido simbiótico pRL1JI y regula, la secreción de Hla. El estudio de la regulación en el pariente heterólogo R. leguminosarum mostró que la secreción de Hla también se ve reprimida por los reguladores globales de respuesta a hierro descriptos en Rhizobiaceae, RirA e IrrA. Por otro lado, el agregado de hemoglobina como fuente de hemo extracelular, indujo la secreción de Hla como proteína mayoritaria en el contexto heterólogo de Rhizobium. El análisis del contexto genético de hla mostró que este gen está incluido en un locus sinténico a otros clusters de genes involucrados en la captación de hemo a través de hemóforos, aunque Hla no presenta similitud de secuencia aminoacídica con hemóforos caracterizados. Sin embargo, la purificación por columna de afinidad de hemina mostró que Hla presenta capacidad de unir hemina y sería el primer hemóforo descripto en la familia Rhizobiaceae. Mediante mutagénesis dirigida se generó una mutante de secreción en aspD de A. tumefaciens C58. Los fenotipos asociados a esta mutante mostraron un carácter pleiotrópico, tanto la autoagregación bacteriana, la adhesión a soporte abiótico y la motilidad en agar se vieron afectadas. En A. tumefaciens la secreción de Hla respondió principalmente a condiciones microóxicas/anóxicas, además de a la ausencia de hierro y presencia de hemo. Interesantemente, la mutante deficiente en la secreción de Hla fue incapaz de inducir la formación de tumores en Kalanchoe sp. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo sugieren que el T1SS AspDE, participaría en la captación de hemo extracelular a través de la secreción de un nuevo hemóforo (Hla) probablemente en condiciones microaerófilas y de bajo hierro presentes en el contexto del tumor.Type I secretion systems (TISSs) enable a wide spectrum of Gram-negative bacteria to deliver proteins to the extracellular medium. This secretion machinery has been shown to be involved in several physiological responses such as adaptation to the environment and virulence. T1SS are composed by an inner membrane component (ABC), a membrane fusion component (MFP) and an outer membrane component (OMP). ABC and MFP are ussually encoded as an operon and they can even be located in adjacency to some of their substrate proteins. The PrsDE System of the related symbiont R. leguminosarum is responsible for the secretion of several proteins that participate in the survival behaviour of rhizobia in the soil by the establishment of structured communities known as biofilms. A. tumefaciens is an important agroeconomical and biotechnological phytopathogen. Despite the physiological relevance of the subject, previous observations suggested the presence of T1SS in A.tumefaciens since C58 strain genome sequences are available (2001), however there have been no advances in the characterization or functional studies of the secretion system in this phytopathogen. In this work, heterologous functional complementation assay has been carried out using an A. tumefaciens genomic library to revert PrsDE mutant strains of R. leguminosarum A34. This strategy allowed us to isolate an A. tumefaciens cosmid, pIJ7760 encoding a T1SS, namely AspDE (Agrobacterium secretion protein D and E). aspD and aspE genes encoded the ABC (ATP binding domain) and MFP (membrane fusion protein) components of the secretion system respectively. Hla, a conserved unknown protein located upstream in the cosmid, was identified as a substrate of AspDE system. The genetic analysis of the surrounding region revealed a putative heme receptor (HlaR) and an ECF sigma and antisigma factor (HlaSI) encoded upstream of Hla. These genes have a RirA (global iron regulation) consensus sequence in their promoter region. Another putative ABC uptake system (AhuUVTB) was identified in pIJ7760 with recognition sequence for RirA and IrrA (heme response regulator). Extracellular protein analysis from different cultured conditions shown that complex and differential control of the secretion of Hla occurs between R. leguminosarum A34 and A. tumefaciens C58 strains. An elevated Hla secretion was observed in rich medium in the R. leguminosarum A34 heterologous host. This miss regulation was found to be in response to a so far unknown mutation which triggers pleiotropic phenotypes. This regulator is encoded in the pRL1JI symbiotic plasmid and appears to regulate Hla secretion. The modulation of Hla secretion was studied using the related strain R. leguminosarum, and revealed that the secretion of the protein is also controlled by the two global regulators previously described in Rhizobiaceae, RirA and IrrA. Additionally, adding hemoglobin as an extracellular heme source induces the secretion of Hla as the major protein in the R. leguminosarum heterologous context. Despite the fact that Hla shows no homology with previously characterized hemophores, the gene is included in a region with remarkable homology to a locus involved in heme uptake through hemophores. Hla was purified from extracellular medium cultures using hemin affinity column suggesting novel hemophore in Rhizobiaceae family. Using directed mutagenesis, an aspD secretion mutant was generated in A. tumefaciens C58 strain. Phenotypic characterization revealed that the mutation has a pleiotropic phenotype affecting the bacterial aggregation, adhesion to an abiotic surface and agar-motility. Studies on A. tumefaciens showed that apart from responding to iron starvation and addition of heme to the medium, Hla secretion mainly responds to microoxic/anoxic conditions. Interestingly, aspD mutant, unable of Hla secretion was avirulet, as shown by incapability of tumor induction in Kalanchoe sp. plants. Taking together, these results suggest that the AspDE Type I Secretion System characterized in this work could be involved in heme uptake through the secretion of a novel hemophore (Hla) probably in the low iron and microaerobiosis present in the tumor.Fil:Haurigot, Lorena Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina