The SCF ubiquitination complex of Trypanosoma brucei and its role in cell cycle regulation

El sistema ubiquitina-proteasoma es una vía reguladora fundamental para controlar la estabilidad de las proteínas dentro de varios procesos celulares, como la señalización y el ciclo celular. En respuesta a señales particulares, proteínas reguladoras específicas son marcadas con una cadena de moléculas de ubiquitina a través de la acción de una cascada enzimática compuesta por una enzima activadora de la ubi- quitina (E1), una enzima conjugadora de la ubiquitina (E2), y una ubiquitina ligasa (E3). Las E3 son responsables de unir los sustratos y acercarlos a la E2 cargada con ubiquitina, la cual luego transfiere la ubiquitina al sustrato y a la siguiente ubiqui- tina de la cadena en una reacción secuencial. Una de las ubiquitina ligasa E3 res- ponsables en el control directo de proteínas involucradas en el ciclo celular es el complejo SCF (SKP1-CUL1-F-box). En esta tesis se estudió cuál es la función de las proteínas que forman parte del complejo SCF en la regulación del ciclo celular de Trypanosoma brucei. El análisis de los genomas de Tripanosomátidos mostró que las cuatro proteínas que forman parte del complejo se encuentran conservadas, a excepción de las proteínas F-box. Utilizando la técnica de ARN de interferencia en los dos estadios del ciclo de vida de Trypanosoma brucei, se determinó en que fase del ciclo celular estas proteínas tienen una función preponderante. Los resultados obtenidos muestran que las subunidades del complejo actúan en diferentes momen- tos del ciclo celular. No solo se demostró que la actividad del complejo SCF es im- portante para el crecimiento de los parásitos in vitro, sino que la enzima conjugadora de ubiquitina es necesaria para que los parásitos establezcan una infección en un hospedador mamífero. A su vez, se utilizó la técnica de Electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) con el objetivo de identificar posibles sustratos del complejo de ubiquitinación. Este trabajo describe por primera vez la actividad de las subunidades homólogas del complejo SCF en el parásito Trypanosoma brucei.The ubiquitin–proteasome system (UPS) is a fundamental regulatory pathway for controlling protein stability that underlies many cellular processes, such as signaling and cell cycle progression. In response to particular signals, specific regulatory pro- teins are tagged with a chain of ubiquitin molecules through the action of an enzyma- tic cascade composed of an E1 ubiquitin activating enzyme, an E2 ubiquitin conjuga- ting enzyme (Ubc), and an E3 ubiquitin ligase. E3s are responsible for binding subs- trates and for bringing substrates into the proximity of a ubiquitin-charged E2, which then transfers ubiquitin to the substrate and to the ensuing ubiquitin chain in a pro- cessive reaction. One of the E3 responsible for the ubiquitination of cell cycle regula- tors is the SCF complex (SKP1-CUL1-F-box). In this thesis, we have studied the function of the proteins that form the core of the SCF complex in the Trypanosoma brucei cell cycle. The analysis of the Trypanosome genomes showed us that the four core subunit homologs are conserved, with the exception of the F-box proteins. Using RNA interference in both life cycle stages of Trypanosoma brucei, we were able to determine the cell cycle stages in which these proteins have important roles. The obtained results show that the subunits of the complex act at diferent points in the cell cycle. Not only we demonstrated that the activity of the complex is important for the parasites growth in vitro, but we showed that the ubiquitin conjugating enzyme is indispensable for establishing an infection in a mammalian host. At the same time, we utilized the Two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) technique for the purpose of identifiying possible substrates of the ubiquitination complex. This work analizes for the first time the activity of the subunits of the SCF complex in a lower eukaryote organism.Fil:Rojas, Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina