Molecular basis for the development of biofilms in Xanthomonas axonopodis pv citri and its role in the infection process

Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, una enfermedad endémica en nuestro país. Xac es capaz de desarrollar biofilms in vitro y sobre hojas, propiedad importante para el desarrollo de esta enfermedad. En esta tesis se buscaron nuevos genes involucrados tanto en la adhesión como en el desarrollo del biofilm. Para esto, se realizaron mutantes en genes candidatos y se utilizó una biblioteca de mutantes generadas al azar. Mediante mutagénesis dirigida se estudiaron los roles del flagelo, de la adhesina FhaB y de los dos sistemas de secreción de tipo II presentes en la bacteria. Todas las mutantes deficientes en estos sistemas tuvieron problemas en la adhesión in vitro. Se observó que las bacterias mutantes en el gen que codifica para las proteínas que conforman el gancho flagelar además presentaron dificultades en el desarrollo del biofilm in vivo y deficiencias en la patogenicidad. A través de la realización de un screening donde se utilizó una colección de mutantes generadas al azar, mediante la inserción del transposón Tn5, se encontraron genes cuya participación en el desarrollo del biofilm de Xac ya se conocía: gumB (codifica para una proteína involucrada en la exportación del xantano), xcsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xcs), xpsD (codifica para la proteína D del sistema de secreción de tipo II xps). También se encontraron nuevos genes implicados en la adhesión de esta bacteria, algunas de estas mutantes presentaron además una importante disminución en su patogenicidad. Se siguió caracterizando en mayor profundidad a una de ellas. La mutante posee una inserción en el gen hrpM, que codifica una glucosiltransferasa implicada en la síntesis de glucanos lineales, de acuerdo a lo que se conoce en otras bacterias. Se observó que esta mutante tiene disminuida su patogenicidad y además es incapaz de sintetizar glucanos cíclicos.Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is the causative agent of citrus canker. This disease is endemic in our country and it attacks different types of cultivars. Xac is able to develop biofilms in vitro and on leaves, a very important property for the development of the disease. In this thesis we look for new genes that were involved in adhesion and biofilm formation. For this, both a generation of mutants in candidate genes and and a library of of randomly generated mutants were used. By directed mutagenesis of candidate genes the roles of flagellar proteins, FhaB adhesin, and two proteins of the two type II secretion systems present in Xac were studied. All these defective mutants had problems with adhesion in vitro. Bacteria lacking the gene coding for the flagellar hook also had problems in the development of biofilm in vivo and was also deficient in pathogenicity. With the aim of finding new genes implicated in the biofilm formation a library of mutants was generated using a Tn5 transposon and tested. Some of the mutants found here were previously known as deficient in adhesion: gumB (polysaccharide export outer membrane protein), xcsD (type II secretion system protein D), xpsD (general secretion pathway protein D). New genes implicated in adhesion were also found, some of these mutants were also severely impaired in the development of canker disease. We continue with the characterization of one mutants. The mutant has an insertion in the hrpM gene, implicated in the elaboration of lineal glucans. We observe that this mutant was impaired in canker development. The synthesis of cyclic glucan was also affected.Fil:Malamud, Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina