Transcriptional regulation of protein kinase a subunits from Saccharomyces cerevisiae

Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiología interna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balance interno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad de perturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando de esta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructuras celulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a una inestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener la homeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalización complejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en el ambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez del ambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichos mecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que están involucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés y diferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares es controlada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consiste en un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por los genes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un único gen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa se encuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario, tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes de carbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación a situaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. La especificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por varios factores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa y del sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción de la quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. La regulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo se buscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de las subunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificar globalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en la regulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de los niveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de los genes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menor de la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben una actividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorio negativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propios genes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, y mediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía de respuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1, interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción río abajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y su reclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de la respuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó un marcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismo fermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas que participan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar al factor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 como represor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activo mediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores de transcripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado de glucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente de carbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducción de señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente de carbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, se realizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevos reguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuente de carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías que regulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology para determinar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a las categorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo de fosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron también genes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por los promotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió como reguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cada subunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos de inositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de las subunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos de fosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a su vez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad de una regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estos procesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además en relación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulación inhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de la expresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega un rol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino de señalización cAMP-PKA.Yeast cells must maintain a specific and delicate balance of their internal physiology to the optimal growth and function. Variations in the environment conditions can result in a variety of cellular perturbations that break the cellular internal equilibrium, and the cells use myriad strategies to maintain these internal conditions in the face of variable and often harsh external. The yeast Saccharomyces cerevisiae has evolved sensing systems and complex signaling pathways to efficiently respond to drastic and abruptly variations in the external environment, as fluctuations of the temperature, osmolarity, acidity, presence of toxics compounds, and large periods of starvation. When environmental conditions change abruptly, the cell must rapidly adjust its genomic expression program to adapt to the new conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cAMP dependent protein kinase A (PKA) controls a wide variety of cellular processes. Yeast PKA consists in a heterotetramer with two catalytic (C) subunits encoded by the TPK1, TPK2 and TPK3 genes, and a dimer of regulatory (R) subunit encoded by the BCY1 gene. One of the best described stimuli activating the PKA is the presence of a fermentable carbon source in the growth medium; while it is necessary to inactivate PKA to allow the switch from fermentative to respiratory metabolism to occur, and to respond to heat and osmotic stress. In general, the specificity of the response to numerous stimuli is determined by several factors as the local cAMP concentration, the expression levels of the kinase and its substrates, the presence or absence of scaffold proteins which limit the interaction among the kinase and its substrates, and the sequence around the phosphorylation site in the substrate. Little is known about the expression levels of the genes encoding PKA subunits. The aim of this work was to characterize the regulation of the promoters transcriptional activity of the genes encoding the subunits of PKA in different growth conditions, including different carbon source and stress, as well as the globally identification of novel metabolic pathways and specific proteins that act as regulators of the PKA subunits transcription. As a first step, employing the reporter gene approach and measuring mRNA levels we determined that the expression level of PKA subunit promoters is different during the growth curve, having TPK1 the highest, then TPK2 and TPK3, and belonging to BCY1 the lowest one. Taking advantage of mutant strains that exhibit a deregulated activity of PKA, or a null activity of PKA, we described the negative isoform-dependent autoregulatory behavior of the enzyme in the expression regulation of its own genes. In heat and osmotic stress conditions, only TPK1 promoter is activated. Employing several strains with simple deletions of genes involved in the heat stress response, we determined that the kinase Rim15 and not the kinase Yak1, participates in TPK1 regulation. Moreover, Msn2, Msn4, Gis1 and Sok2, which are transcription factors downstream of both Rim15 and Yak1 kinases, contribute to the upregulation of TPK1 promoter, and ChIP assays revealed its presence on the promoter. On the other hand, the study of the promoters activity in the presence of glycerol as carbon source (respiratory metabolism), showed a marked increment in the promoters activity in comparison with the growth in glucose (fermentative metabolism). Using deletion mutants of proteins involved in the carbon source signal transduction pathway, we identify the Mig1 transcription factor as a repressor of the TPK1 and TPK2 promoters; Mig2, as a repressor of TPK2 and BCY1 promoters, and Mig3, as a repressor of BCY1 promoter. By ChIP assays we corroborate the presence of Mig1 on the transcriptionally active TPK1 promoter. The kinase Snf1, and its downstream effectors, the transcription factors Cat8 and Sip4, all of them having an important role under glucose starvation, regulate the activity of the four PKA subunits promoters in the presence of this carbon source. Taking into account the implication of PKA in several transduction pathways, and that the heat stress response pathway and the carbon source pathway are implicated in the regulation of the activity of the promoters of the genes encoding PKA subunits, we carried out a genomic study using robotic technology (Reporter-Synthetic Genetic Array technique), with the aim of globally identify novel regulators of the transcription. This study was performed with cells grown in fermentable carbon source. The massive analysis let us discovering distinct pathways that differentially regulate the activity of the four promoters of the PKA subunits. The identified regulators were classified according to Gene Ontology database to determine enrichment in categories. Distinct genes belonging to transcription, mitochondria functioning, vacuolar functioning and phosphate metabolism affected the activity of the four promoters. Besides we identified genes in different regulatory categories which are not shared by the four promoters, as lipid metabolism which affects the TPK1, TPK2 and TPK3 transcription. Moreover the list of genes belonging to categories regulating the four promoters is not equal. Further characterization of the results pointed to inositol and inositol polyphosphates, choline and phosphate as novel upstream signals that regulate transcription of PKA subunit genes. In general, from this work we conclude that many of the known targets of PKA phosphorylation are associated with the transcriptional regulation of PKA subunits, opening the possibility of a reciprocal regulation in which PKA would be coordinating different metabolic pathways and these processes would in turn, regulate expression of the kinase subunits. This concept is in concordance with the results of the first part of this work that showed an inhibitory regulation of the PKA promoters by its own kinase activity. The overall conclusion is that the differential expression regulation of the PKA subunits plays an important role in determining the specificity of the response in the cAMP-PKA signaling transduction pathway.Fil:Pautasso, María Constanza. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina