Study on prebiotic of feruloyl oligosaccharides on the growth of Lactobacillus spp

目錄 中文摘要 ii Abstract iv 誌謝 vi 目錄 vii 圖目錄 x 表目錄 xi 第一章前言 - 1 - 第二章文獻回顧 - 3 - 2.1. 乳酸菌的定義 - 8 - 2.2.乳酸菌的保健功效 - 10 - 2.3.膽鹽濃度對乳酸菌降低膽固醇之能力探討 - 16 - 2.4.膽鹽水解酵素（Bile salt hydrolase, BSH） - 17 - 2.5.乳酸菌的篩選 - 18 - 第三章材料與方法 - 20 - 3.1.實驗材料與儀器 - 20 - 3.1.農業廢棄物之製備 - 24 - 3.1.1阿魏酸寡醣的製備 - 24 - 3.2.乳酸菌株篩選 - 24 - 3.2.1.鏡檢及革蘭氏染色 - 25 - 3.2.2.凝乳試驗 - 25 - 3.2.3.觸酶試驗（Catalase） - 25 - 3.2.4. 16S rRNA鑑定 - 26 - 3.3.膽鹽水解酶分析（TLC法） - 27 - 3.3.1.膽鹽水解酵素測定 - 28 - 3.4.蛋白質測定 - 29 - 3.5.膽固醇移除分析方法 - 29 - 3.6.耐酸試驗 - 30 - 3.7.於不同時間菌體及膽固醇移除之探討 - 30 - 3.8.總碳水化合物分析 - 31 - 3.9.不同碳水化合物對乳酸菌生長影響 - 31 - 3.10. 氧自由基吸收能力分析法 - 32 - 第四章結果與討論 - 33 - 4.1.乳酸菌的篩選 - 33 - 4.1.1.革蘭氏染色、鏡檢、凝乳試驗及觸酶試驗 - 33 - 4.1.2. 16S rRNA鑑定 - 34 - 4.3.具膽鹽水解酵素之初步篩選 - 35 - 4.3.1. 膽鹽水解酵素活性分析 - 35 - 4.4. 膽固醇移除能力 - 36 - 4.4.1.生長中乳酸菌對膽固醇移除能力試驗 - 36 - 4.4.2 .以殺滅之乳酸菌對膽固醇移除能力試驗 - 37 - 4.5.耐酸試驗 - 38 - 4.6.不同時間對乳酸菌生長及降低膽固醇之影響 - 39 - 4.7.不同碳水化合物對乳酸菌生理功能探討 - 40 - 第五章 結論 - 42 - 參考文獻 - 54 - 附錄 - 61 - 圖目錄 圖1﹒膽鹽的合成與BSH降低膽固醇的作用 - 15 - 圖2﹒篩選益生菌的安全性考量步驟 - 19 - 圖3﹒乳酸菌移除膽固醇能力之探討 - 47 - 圖4﹒乳酸菌於pH 2環境下不同時間存活率之探討 - 48 - 圖5﹒L. reuteri Lac30生長與膽固醇移除之探討 - 49 - 圖6﹒L. reuteri Lac30 於不同碳碳水化合物之生長曲線探討 - 50 - 圖7﹒L. reuteri Lac30於不同碳水化合物生長所產生BSH活性之探討 - 51 - 圖8﹒L. reuteri Lac30 於不同碳水化合物生長後的菌體耐酸之探討 - 52 - 圖9﹒不同發酵液對氧自由基吸收能力分析 - 53 - 表目錄 表1﹒目前發現已知具有降低膽固醇的菌株 - 13 - 表2﹒所分離之菌株16S rRNA之序列比對結果 - 43 - 表3﹒好氧及厭氧培養下膽鹽水解酵素之定性 - 44 - 表4﹒乳酸菌於厭氧培養下之膽鹽水解酵素活性產生 - 45 - 表5﹒乳酸菌於好氧培養下之膽鹽水解酵素活性產生 - 46 -[[abstract]]血管中膽固醇堆積及氧化所造成的心血管疾病是台灣主要的死因，因此如何降低血脂及預防膽固醇的氧化等相關研究一直受到討論。阿魏酸寡醣已被發現較游離阿魏酸具良好的水溶性與抗氧化能力，也顯示出對LDL-膽固醇的氧化有顯著的抑制作用，因此本研究擬篩選具膽固醇移除能力的菌株，並測試阿魏酸寡醣是否可充當益菌生的能力，並評估其發酵液的相關功能。 具移除膽固醇能力乳酸桿菌的篩選，主要考量於菌的膽鹽水解酵素活性、膽固醇移除能力、膽固醇吸附能力及耐酸程度。由實驗結果顯示，L. reuteri具有0.57±0.07 U/mg的膽鹽水解酵素活性、75.09±1.60%的膽固醇移除能力及經pH 2條件下二小時後，108 cfu/mL的起始菌數仍有105 cfu/mL的菌數存活，因此被選擇進行其生長與膽固醇的移除的探討，結果發現二者具有同步化趨勢，顯示膽固醇可能可充當此菌的生長營養物。 為了評估阿魏酸寡醣是否具促進菌增生的效能，將L. reuteri於等量總碳水化合物的不同碳源中培養，結果發現阿魏酸寡醣對菌的增生能力遠高於木寡糖與葡萄糖；而在培養24小時候所收集的菌體中，可發現以阿魏酸寡醣培養的菌體耐酸性最好，而所產之膽鹽水解酵素的比活性則以木寡糖較高；另外以其培養液進行ORAC抗氧化，結果顯示阿魏酸寡醣發酵液對過氧自由基的清除能力優於其他基質的發酵液，其效能約為0.1mg Trolox含量。 Cardiovascular disease, the major cause of death in Taiwan,is a result of plaque buildup in the blood vessels which was caused by cholesterol accumulation and oxidation. To reduce the cardiovascular disease, several studies in reducing the total plasma cholesterol and preventing the LDL oxidation were conducted among worldwide. Feruloyl oligosaccharide (FAO) was found to exhibit more water solubility and antioxidant activity than free ferulic acid. FAO was also show the significantly effect in LDL oxidation inhibition. In order to evaluate the feasibility of FAO as a prebiotic, screen a potential cholesterol-removal strain of Lactobacillusspp., effect of FAO to the cell growth and the functions of fermented supernatant were examined in this work. To screen a potential cholesterol-removal strain of Lactobacillus.is based on the criteria of its bile salt hydrolase (BSH) activity, cholesterol assimilation ability, cholesterol adsorption ability and relative gastric acid tolerance. L. reuteri was selected from 27 strains of Lactobacillus spp.in this work. L. reuteri was found with 0.57±0.07 U/mg of BSH activity, can remove75.09±1.60% of cholesterol from medium, can remove 45% cholesterol by dead cells from medium and have 105 cfu/mL survivals after incubated under pH 2 medium for 2 hrs with a initial 108 cfu/mL cell concentration. In the time course study, results showed L. reuteri growth was in proportion to the cholesterol depletion. This demonstrated cholesterol could be a nutrient that L. reuteri could be uptaken for growth. Furthermore, FAO was found superior than other carbon sources in stimulating L. reuteri growth. After incubated at different carbon sources for 24 hours, the cells collected from FAO media also show the related higher BSH activity and degree of acid tolerance. And the media after fermented with different carbon sources, media from FAO fermented show higher peroxyl radical scavenging activity and correspond to 0.1mg Trolox