The analysis of the pathogenicity relative genes in Pectobacterium chrysanthemi

研究生中文名： 蔡孟庭 研究生外文名： Meng-Ting Tsai 論文中文名稱： Pectobacterium chrysanthemi 病原性相關基因之分析 論文外文名稱： The analysis of the pathogenicity relative genes in Pectobacterium chrysanthemi 指導教授： 中文名： 朱木貴 外文名： Mu-Kuei Chu 指導教授E-mail： mukuei.chu@gmail.com 口試委員： 中文名： 李佩芳 外文名： 中文名： 陳月茸 外文名： 口試日期： 2013-07-29 學位類別： 碩士 院校名稱： 中華醫事科技大學 系所名稱： 生物醫學研究所 畢業學年度： 102 論文出版年： 2013 學號： A00030034 語文別： 中文 論文頁數： 86 中文關鍵詞： 軟腐病菌 病原性相關基因 外文關鍵詞： Pectobacterium chrysanthemi 個人網址名稱： 個人網址： E-mail： wen.wen5221@gmail.com 狀態： 基本資料建檔已完成 論文中文摘要： 蝴蝶蘭是全球最受歡迎的觀賞植物也是為台灣重要外銷觀賞植物之一，近年來蝴蝶蘭已成為台灣重要的外銷花卉，其經濟栽培面積大幅擴增，但因溫室栽培環境高溫多濕，若種植過程管理不當，則易助長蝴蝶蘭病害之發生與蔓延，造成蘭園重大之損失。而蝴蝶蘭細菌性病害的主要的病原菌有三種，分別為褐斑病菌(Acidovorax avenae subsp. cattleyae)、葉斑病菌(Burkholderia gladioli)及軟腐病菌(Pectobacterium chrysanthemi)，而其中以軟腐病菌最為嚴重。本研究擬利用生物資訊學比對及分析軟腐病菌Pectobacterium chrysanthemi中第一型及第三型分泌系統中病原性相關之基因，希望能從這些篩選出可鑑別PCH及PCC差異之序列，並開發專一性引子組。本研究從NCBI Genomes資料庫中匯整Pectobacterium chrysanthemi 第一型分泌系統外膜蛋白基因與第三型分泌系統之hrp基因群序列，作為鑑別PCH及PCC分析之依據。利用生物資訊學已篩選出第一型分泌系統之eprF基因及第三型分泌系統之hrcJ、hrcT、hrcU、hrpL、hrpN及hrpX基因，都可用於開發PCR鑑定技術之用途。研究中利用分生技術已成功選殖上述hrp基因群，並將選殖株之基因序列以BLAST軟體進行比對，研究發現選殖株之序列對NCBI資料庫中PCH之hrcJ、hrcT、hrcU、hrpL、hrpN及hrpX基因的相似度分別介於88-96％、83-93％、83-92％、89-96％、85-88％及80-91％。而選殖株之序列對NCBI資料庫中PCC的相似度則較低，依序分別為73％、73％、72％、71％、74％及70％。序列間之異同可用於專一性引子組之開發，本研究已成功利用多序列比對結果設計出專一性引子組，初步測試可用於PCH及PCC的鑑別。此外對於致病相關基因有系統性的分析，發現在許多基因序列對不同來源之PCH仍有程度上的差異，是否與寄主專一性有關仍有待進一步了解。本研究中已成功選殖及表現出eprF基因，此基因的DNA長度為1389bp、分子量為52kDa，相似度為96％，確定為研究中選殖之基因，未來可大量表現蛋白質並純化，期可在抗體製作上加以進行，進一步利用免疫磁珠PCR及ELISA-PCR以增加檢測之敏感度。 論文外文摘要： Phalaenopsis became the most important products in the agriculture, the cultivation area of orchids increased rapidly. Growing the orchid in the greenhouse caused by the increasing of the temperature and humidity would yield the phytobacteria diseases, which caused enormous losses. The important phytobacteria were Acidovorax avenae subsp. cattleyae, Burkholderia gladioli and Pectobacterium chrysanthemi which caused infected diseases on orchids. One of the most serious bacterial disease agents is Pectobacterium chrysanthemi in Taiwan. This study plans to understand the pathogenicity relative genes in the type I and type III secretion system from Pectobacterium chrysanthemi. In this study, we attend to analysis the diversity between PCH and PCC, and to develop the specific primer-pairs for PCR detection. We collect the sequences of type I secretion system gene and type III secretion system genes to make the database respectively. We use the software of multiple sequences alignment to analysis the similarity among different database to understand the diversity to design specific primers. These specific primer-pairs from different genes would be used to identify PCH. Furthermore we have cloned the genes included hrcJ, hrcT, hrcU, hrpL, hrpN and hrpX genes into E. coli. The sequences of hrcJ, hrcT, hrcU, hrpL, hrpN and hrpX were used to BLAST analysis, that revealed the similarity are 88-96% ,83-93%, 83-92%,89-96%,85-88% and 80-91% to PCH,respectively. The sequences BLAST analysis to PCC revealed the similarity are 73%,73%, 72%, 71%, 74% and 70%, respectively. This study has been used the diversity of multiple sequence alignment to design specific primers. The PCR tests reveal the accuracy to PCH. This study has successfully demonstrated eprF gene, the DNA length is 1389bp, the molecular weight is 52kDa and the similarity is 96%, determine the gene for the study, overexpression of the protein and purification of antibody production Future study immuno-magnetic PCR and ELISA-PCR in order to increase the detection sensitivity. 狀態： 中外文摘要建檔已完成 論文目次： 目錄 口試委員審定書 授權書 中文摘要................................................................................................................III 英文摘要.................................................................................................................V 致謝.......................................................................................................................VII 壹、 前人研究.......................................................................................................2 一、蝴蝶蘭簡介................................................................................................2 二、蝴蝶蘭產業發展狀況................................................................................3 三、蘭花細菌性病害之種類............................................................................4 (一). 蘭花細菌性褐斑病........................................................................4 (二). 蘭花細菌性葉斑病........................................................................6 (三). 蘭花細菌性軟腐病........................................................................7 四、Pectobacterium之分泌系統..................................................................11 五、研究目的................................................................................................13 貳、 材料與方法.................................................................................................15 一、材料.......................................................................................................15 (一). 菌株來源、培養及保存.............................................................15 (二). 培養基........................................................................................15 二、染色體DNA的萃取................................................................................15 三、聚合酶連鎖反應....................................................................................16 四、PCR產物之純化....................................................................................16 五、PCR產物與質體之接合作用.................................................................17 六、核酸轉型作用........................................................................................17 七、DNA定序與引子組設計.......................................................................17 八、 PCR產物之膠體電泳分析....................................................................18 九、生物資訊分析..........................................................................................18 十、基因之蛋白質表現及純化......................................................................18 十一、蛋白質表現之分析..............................................................................19 (一). SDS-PAGE分析.........................................................................19 (二). 膠體染色...................................................................................19 (三). 西方墨點(Western Blotting).....................................................19 參、 結果.............................................................................................................21 一、第三型分泌系統hrpL基因之分析......................................................21 二、第三型分泌系統hrcT基因之分析......................................................22 三、第三型分泌系統hrcJ基因之分析......................................................22 四、第三型分泌系統hrpN基因之分析.....................................................23 五、第三型分泌系統hrcU基因之分析.....................................................24 六、第三型分泌系統hrpB基因之分析....................................................25 七、第三型分泌系統hrpX基因之鑑定......................................................25 八、利用表現載體來分析eprF基因之表現...........................................26 肆、 討論.............................................................................................................27 伍、 參考文獻.....................................................................................................29 陸、 圖表.............................................................................................................42 表1 本研究所使用菌株名稱、宿主及其分離地點............................................43 表2 本研究所使用引子組之名稱及核酸序列................................................44 表3 Pectobacterium chrysanthemi及Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum基因體中hrpL之相似度分析........................................................46 表4 Pectobacterium chrysanthemi及Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum之染色體DNA以不同引子組所進行之PCR分析結果.............47 表5 Pectobacteriumchrysanthemi及Pectobacteriumcarotovorum subsp. Carotovorum之菌株分離來源及其註冊碼..........................................................48 圖1 Pectobacterium chrysanthemi及Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum基因體中hrpL之相似度分析..........................................................49 圖2 以多序列比對軟體ClustalW分析第三型分泌系統之hrpL基因序列 間之親緣關係圖....................................................................................................51 圖3 PCH菌株基因體中選殖之hrpL基因序列的BLAST分析……….....…. 52 圖4 PCH及PCC染色體以引子組(hrpL-F及hrpL-R)所進行之PCR鑑定 結果........................................................................................................................53 圖5 以多序列比對軟體ClustalW分析第三型分泌系統之hrcT基因序列 間之親緣關係圖....................................................................................................54 圖6 PCH染色體DNA以引子組(hrcT-F與hrcT-R)所進行之PCR增幅 結果........................................................................................................................55 圖7 PCH菌株基因體中選殖之hrcT基因序列的BLAST分析…...................56 圖8 PCH及PCC染色體以引子組(hrcT-F及hrcT-R)所進行之PCR鑑定 結果........................................................................................................................57 圖9 以多序列比對軟體ClustalW分析第三型分泌系統之hrcJ基因序列 間之親緣關係圖....................................................................................................58 圖10 PCH及PCC染色體以引子組(hrcJ-F與hrcJ-R)所進行之PCR鑑定 結果........................................................................................................................59 圖11 PCH菌株基因體中選殖之hrcJ基因序列的BLAST分析…………..60 圖12 PCH及PCC染色體以引子組(hrcJ-F與hrcJ-R)所進行之PCR鑑定 結果........................................................................................................................61 圖13 以多序列比對軟體ClustalW分析第三型分泌系統之hrpN基因序列 間之親緣關係圖....................................................................................................62 圖14 PCH菌株基因體中選殖之hrpN基因序列的BLAST分析……………63 圖15 PCH及PCC染色體以引子組(hrpN-F與hrpN-R)所進行之PCR鑑定結 果........................................................................................................................64 圖16 PCH及PCC染色體以引子組(hrcU-F與hrcU-R)所進行之PCR鑑定 結果........................................................................................................................65 圖17 PCH菌株基因體中選殖之hrcU基因序列的BLAST分析………….....66 圖18 PCH及PCC染色體以引子組(hrpB-F與hrpB-R)所進行之PCR鑑定 結果........................................................................................................................67 圖19 PCH菌株基因體中選殖之hrpB基因序列的BLAST分析.....................68 圖20 PCH菌株基因體中選殖之hrpX基因序列的BLAST分析……….…....69 圖21 PCH及PCC染色體以引子組(hrpX-F與hrpX-R)所進行之PCR鑑定結果............................................................................................................................70 圖22 EprF-pQE30之構築示意圖......................................................................71 圖23 EprF-pQE30蛋白質在大腸桿菌中之表現..............................................72 圖24 選殖株之蛋白在pQE30/M15表現系統中之Western blotting 分析…..73 柒、 附錄.............................................................................................................74 附錄1 第三型分泌系統之hrp相關基因群.......................................................75 附錄2 植物酚酸在第三型分泌系統之路徑......................................................76[[abstract]]蝴蝶蘭是全球最受歡迎的觀賞植物也是為台灣重要外銷觀賞植物之一，近年來蝴蝶蘭已成為台灣重要的外銷花卉，其經濟栽培面積大幅擴增，但因溫室栽培環境高溫多濕，若種植過程管理不當，則易助長蝴蝶蘭病害之發生與蔓延，造成蘭園重大之損失。而蝴蝶蘭細菌性病害的主要的病原菌有三種，分別為褐斑病菌(Acidovorax avenae subsp. cattleyae)、葉斑病菌(Burkholderia gladioli)及軟腐病菌(Pectobacterium chrysanthemi)，而其中以軟腐病菌最為嚴重。本研究擬利用生物資訊學比對及分析軟腐病菌Pectobacterium chrysanthemi中第一型及第三型分泌系統中病原性相關之基因，希望能從這些篩選出可鑑別PCH及PCC差異之序列，並開發專一性引子組。本研究從NCBI Genomes資料庫中匯整Pectobacterium chrysanthemi 第一型分泌系統外膜蛋白基因與第三型分泌系統之hrp基因群序列，作為鑑別PCH及PCC分析之依據。利用生物資訊學已篩選出第一型分泌系統之eprF基因及第三型分泌系統之hrcJ、hrcT、hrcU、hrpL、hrpN及hrpX基因，都可用於開發PCR鑑定技術之用途。研究中利用分生技術已成功選殖上述hrp基因群，並將選殖株之基因序列以BLAST軟體進行比對，研究發現選殖株之序列對NCBI資料庫中PCH之hrcJ、hrcT、hrcU、hrpL、hrpN及hrpX基因的相似度分別介於88-96％、83-93％、83-92％、89-96％、85-88％及80-91％。而選殖株之序列對NCBI資料庫中PCC的相似度則較低，依序分別為73％、73％、72％、71％、74％及70％。序列間之異同可用於專一性引子組之開發，本研究已成功利用多序列比對結果設計出專一性引子組，初步測試可用於PCH及PCC的鑑別。此外對於致病相關基因有系統性的分析，發現在許多基因序列對不同來源之PCH仍有程度上的差異，是否與寄主專一性有關仍有待進一步了解。本研究中已成功選殖及表現出eprF基因，此基因的DNA長度為1389bp、分子量為52kDa，相似度為96％，確定為研究中選殖之基因，未來可大量表現蛋白質並純化，期可在抗體製作上加以進行，進一步利用免疫磁珠PCR及ELISA-PCR以增加檢測之敏感度。 Phalaenopsis became the most important products in the agriculture, the cultivation area of orchids increased rapidly. Growing the orchid in the greenhouse caused by the increasing of the temperature and humidity would yield the phytobacteria diseases, which caused enormous losses. The important phytobacteria were Acidovorax avenae subsp. cattleyae, Burkholderia gladioli and Pectobacterium chrysanthemi which caused infected diseases on orchids. One of the most serious bacterial disease agents is Pectobacterium chrysanthemi in Taiwan. This study plans to understand the pathogenicity relative genes in the type I and type III secretion system from Pectobacterium chrysanthemi. In this study, we attend to analysis the diversity between PCH and PCC, and to develop the specific primer-pairs for PCR detection. We collect the sequences of type I secretion system gene and type III secretion system genes to make the database respectively. We use the software of multiple sequences alignment to analysis the similarity among different database to understand the diversity to design specific primers. These specific primer-pairs from different genes would be used to identify PCH. Furthermore we have cloned the genes included hrcJ, hrcT, hrcU, hrpL, hrpN and hrpX genes into E. coli. The sequences of hrcJ, hrcT, hrcU, hrpL, hrpN and hrpX were used to BLAST analysis, that revealed the similarity are 88-96% ,83-93%, 83-92%,89-96%,85-88% and 80-91% to PCH,respectively. The sequences BLAST analysis to PCC revealed the similarity are 73%,73%, 72%, 71%, 74% and 70%, respectively. This study has been used the diversity of multiple sequence alignment to design specific primers. The PCR tests reveal the accuracy to PCH. This study has successfully demonstrated eprF gene, the DNA length is 1389bp, the molecular weight is 52kDa and the similarity is 96%, determine the gene for the study, overexpression of the protein and purification of antibody production Future study immuno-magnetic PCR and ELISA-PCR in order to increase the detection sensitivity