Determination of genomic sequence of Watermelon bud necrosis virus and quick identification of tospoviruses using degenerate primer pairs

[[abstract]]番茄斑萎病毒屬 (the genus Tospovirus) 為布尼亞病毒科 (Bunyaviridae) 中唯一感染植物之一屬，其基因體由三條單股RNA片段所組成，依其大小分別命名為S、M、L，可分別轉譯出六種蛋白產物。Tospovirus之分類即根據S RNA上所轉譯出來的核鞘蛋白 (nucleocapsid protein，NP) 同源性 (homology) 來決定的。目前為止，本屬共發現有十九種 (species) 不同的病毒。然而，除了NP的序列已完全解出之外，其他病毒產物的基因體轉譯序列並未完全定序。本研究將完整呈現西瓜頂芽壞疽病毒 (Watermelon bud necrosis virus，WBNV) 的全基因體序列。WBNV的S RNA由3,402個核苷酸組成，為雙極性片段，病毒股RNA對應轉譯出含439個胺基酸的非結構性NSs蛋白，其互補股RNA產生275個胺基酸的NP。M RNA含有4,794個核苷酸亦為雙極性片段，病毒股對應產生307個胺基酸的非結構性NSm蛋白，而互補股則對應產生1,121個胺基酸的Gn和Gc醣蛋白的前驅物。L RNA共具8,914個核苷酸，為負極性片段，互補股對應產生2,878個胺基酸的RNA依賴性RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。序列分析結果顯示WBNV和花生頂芽壞疽病毒 (Peanut bud necrosis virus，PBNV)、西瓜銀斑病毒 (Watermelon silver mottle virus，WSMoV)、和甜椒黃化病毒 (Capsicum chlorosis virus，CaCV) 的基因體序列展現高度相似性。另一方面，從已知的病毒序列中設計新的簡併性引子對 (degenerate primer pairs)，並和已發表的簡併性引子對同時進行病毒檢測鑑定。本論文中針對下列十三種病毒：WBNV、PBNV、WSMoV、CaCV、番茄斑點萎凋病毒 (Tomato spotted wilt virus，TSWV)、花生輪點病毒 (Groundnut ringspot virus，GRSV)、番茄黃化斑點病毒 (Tomato chlorotic spot virus，TCSV)、鳳仙花壞疽斑點病毒 (Impatiens necrotic spot virus，INSV)、彩色海芋黃斑病毒 (Calla lily chlorotic spot virus，CCSV)、鳶尾花黃斑病毒 (Iris yellow spot virus，IYSV)、甜瓜黃斑病毒 (Melon yellow spot virus，MYSV)、花生黃化扇斑病毒 (Peanut chlorotic fan-spot virus，PCFV)、以及番茄黃化輪點病毒 (Tomato yellow ring virus，TYRV)，利用反轉錄聚合酶連鎖反應 (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 加以測試。使用gL3637/gL4510c或M1/tNSm400c均可測得所有測試的病毒。若使用tNSm410/tNSm870或t2740/t3920，則除PCFV外，上述十二種病毒均可檢測出來。如果想檢測WSMoV和IYSV血清群病毒 (WSMoV、CaCV、CCSV、MYSV、WBNV、PBNV、IYSV、TYRV)，則可使用WG1/WG960或Gp2150/Gp2730c。在本研究中我們發展出利用簡併性引子對配合One-Step RT-PCR快速檢測tospoviruses的方法，此法亦可應用在解開未知tospoviruses的序列中