Partial Purification And Characterization Of Alkaline Proteases From Isolated Bacillus Strains

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2005Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2005Proteazlar, proteinleri kısa peptitlere veya serbest aminoasitlere parçalayan ve organik çözücüler içinde peptit sentezini katalizleyen enzimlerdir. Proteazların deterjan, gıda, deri, ilaç ve diğer biyoteknoloji endüstrilerinde birçok uygulama alanları vardır. Alkali proteazlar, bakteri, küf, maya gibi birçok çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilirler. Bakteriler arasında hücre dışı proteaz üretimi özellikle Bacillus türüne özgüdür. Bu çalışmada, deri sanayinin atık sularından farklı Bacillus türleri izole edilmiş ve proteaz enzimi üretimleri araştırılmıştır. Çeşitli deri fabrikalarından alınan atık su numunelerinde mikroorganizmalar, özellikle de Bacillus türü aranmıştır. Dört farklı proteaz üreticisi olabilecek tür gözlenmiş ve Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus cereus olarak tanımlanmıştır. Türlerin tanımlanması ve proteaz üretiminin gözlenmesi standart test kitlerinin kullanımıyla gerçekleştirilmiştir. Bacillus türlerince üretilen proteazlara, amonyum sülfat ile çöktürme yöntemi uygulanmıştır. Elde edilen Bacillus pumilus proteazının çökeltileri konsantre edilmiş çözeltiler halinde UNO Q-6 iyon değiştirme kolon kromatografi sistemine yüklenmiştir. Kromatografi sonunda elde edilen aktif fraksiyonlar Millipore santrifüj üniteleri ile konsantre edilmiştir. Bu örneklerin molekül ağırlıkları SDS-PAGE yöntemi ile belirlenmiştir. Kısmi olarak saflaştırılan proteaz enzimlerinde sıcaklık ve pH’nın enzim aktivitesi ve stabilitesi üzerine olan etkileri incelenmiştir. Ayrıca metal iyonları ve çeşitli kimyasalların enzimlerin aktivitesi üzerinde olan etkileri de belirlenmiştirProteases are enzymes that hydrolyze proteins to short peptides or free amino acids and catalyze peptide synthesis in organic solvents. Proteases have a large variety of applications in the detergent, food, leather, pharmaceutical and other biotechnology industries. Alkaline proteases are produced by a wide range of microorganisms including bacteria, moulds, yeasts. Among bacteria, Bacillus species are specific producers of extracellular proteases. In this study, different Bacillus species were isolated from the waste waters of tannery industry and they were screened for their ability to produce alkaline protease. Samples collected from different leather factories were screened for their content of microorganisms, specially for the genus Bacillus. Four potential producers were examined and identified as Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus and Bacillus cereus. Identification of the genus and detection of protease production were carried out by using standardized detection kits. Extracellular alkaline proteases produced by these Bacillus isolates were purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation. Concentrated solution of Bacillus pumilus protease precipitates was loaded onto UNO Q-6 ion exchange column in a fast protein liquid chromatography system. Active fractions were concentrated with Millipore centrifugal filter unit. Their molecular weights were estimated by SDS-PAGE analysis. Effect of pH and temperature on the stability and activity of the purified enzymes were further studied. Effect of metal ions and chemicals on the activity of purified enzymes were determined.Yüksek LisansM.Sc