Evolutionary Engineering Strategy For The Adaptation To Cobalt Stress In A Carotenoid Producing Yeast

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2014Rhodotorula spp. tomurcuklanarak çoğalan, karotenoid üreten, kapsüllü, tek hücreli maya cinsidir. Karotenoid üretimi biyoteknolojik uygulamalarda ticari olarak önemli rol oynar. Karotenoidler gıdalarda doğal renklendirici ve hayvan yemlerinde besleyici katkı maddesi olarak kullanılırlar. İlaç endüstrisinde kanser ve yaşlanma karşıtı ajan olarak kullanılırlar. Çünkü karotenoidlerin antioksidan ve provitamin-A özellikleri serbest radikallere ve singlet oksijene karşı koruma sağlar. Karotenoidler karotenler (hidrokarbon sınıfı) ve ksantofiller (oksijen veren türevleri) olmak üzere iki familyaya ayrılır. İkincil metabolit olup yapısal olarak organik özellik gösteren karotenoidler membran akışkanlığını ve termostabilitesini etkilerler. Membrandaki yerleri karotenoidin çeşidine göre farklılık gösterir. Çözelti içerisinde serbest halde bulunmazlar. Rengin belirlenebilmesi için en az 7 tane konjuge çift karbon bağı gereklidir. Görünür absorpsiyon spektrofometresi karotenoid türünün tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için kullanılabilir. Konjuge çift karbon bağı sayısı arttıkça dalgaboyu artar. Genellikle karotenoidler 3 dalgaboyunda en yoğun absorbsiyonu gösterir. Karotenoidlerin antioksidant / prooksidant özellik göstermesi karotenoid molekülünün yapısal ve fiziksel formuna, hücre içindeki lokasyonuna veya aksiyon merkezine, diğer karotenoid veya antioksidanlar ile potensiyel etkileşimine, karotenoid konsantrasyonuna ve kısmi oksijen basıncı özelliklerine bağlıdır. Geçiş elementleri periyodik tabloda IIA ve IIIA arasında kalan nikel, çinko, kobalt, manganez, bakır ve demir gibi metallerin bulunduğu gruptur. Geçiş metallerinin karotenoid üretiminde olumlu etkisi olduğu gözlemlenmiştir. Bunu, reaktif oksijen türevlerini arttırarak ya da karotenoid üretimindeki enzimler kofaktör olarak bulunarak gerçekleştirirler. Isı, ultraviole ışık, metal stresi gibi çevresel streslerin hücre yapısına zarar vererek reaktif oksijen türevlerinin seviyesini arttırdığı bilinmektedir. Kobalt doğada yaygın olarak bulunan geçiş metallerinden biridir. Siyanokobalaminin (B12 vitamini) bir kısmında bulunması sebebiyle insanlar için önemlidir. Fakat kobaltın yüksek konsantrasyonda bulunması toksik etki yapmaktadır. Kobaltın endüstriyel kullanımı da yaygındır. Uçak motoru, mıknatıs, kesme-doğrama araçları, yapay diz ve kalça üretimleri endüstrideki kullanımına örnek olarak verilebilir. Metabolik mühendislik, hücre içindeki metabolik akışların doğrudan değiştirilmesini konu alan çalışma alanıdır. Bu çalışma alanı, hücrelerin doğal yolla ürettikleri metabolitlerin miktarını artırmak ya da doğal olarak üretilmeyen metabolitlerin yapay yolla üretilmesini sağlamayı amaçlar. Günümüzde stres toleransının geliştirilmesinden, mikrobiyal üretim potansiyelinin artırılmasına kadar birçok alanda kullanılmaktadır. Metabolik akışların ayarlanmasında, analizinde ve modellenmesinde gerçekleştirilen teknolojik gelişmeler, bu çalışma alanını daha da popüler kılmaya başlamıştır. Metabolik mühendisliğin üzerine inşa edilen, genetik mühendislik ve tersine metabolik mühendislik bu araştırma dalının çalışma alanını daha da genişletmektedir. Tersine metabolik mühendislik metabolik mühendisliğin bir alt disiplini olduğunu belirtmiştir. Bu tür mühendislikte ilk olarak istenilen, aranılan fenotipin tanımlanması, yapımı veya hesaplanması; ardından, bu fenotipik özelliğe neden olan genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi ve son olarak, tespit edilen genetik faktörlerin, diğer suş veya organizmalara aktarılması gerçekleşir. Evrimsel mühendislik, deneme-yanılmaya bağlı suş geliştirilmesi ile ilgili tüm teknikleri içeren bir terimdir. Bu bağlamda, rastgele genetik mutasyonlar yapılır sonrasında aranılan fenotipe göre tarama işlemlerinin sıralı olarak gerçekleştirilmesi, çoğu zaman fenotipik açıdan avantaja neden olacak genetik çeşitliliklere neden olmaktadır. Evrimin rastgele mutasyon ve seçilim prensibinin uygulandığı bu teknikler, var olan suşların geliştirilmesinde oldukça etkili olmaktadır. Sadece evrimsel mühendislik kullanılarak geliştirilen birçok suş, deneylerde oldukça tatmin edici sonuçlar vermiştir. Evrimsel mühendislik, son basamağında taramaya (seçilime) gerek duyduğu için, bu teknikler genellikle, teste tabii tutulabilecek fenotipik gelişimlere ihtiyaç duyar. Tarama işlemleri, bu fenotipik başarılar kıyaslanarak gerçekleştirilir. Bundan dolayı, sadece test edilebilecek fenotipik özelliklerin bu yolla geliştirilmesi mümkündür. Bu fenotipik karşılaştırmalar, genellikle büyüme oranı üzerinden yapılmaktadır. Evrimsel mühendislik, içerdiği rastgele işleyen metotlardan dolayı, metabolik mühendislikten ayrılır. Burada rastgele işleyen metottan kasıt, metotların rastgele sonuçlar doğurmasıdır. Kullanılan genetik modifikasyonlar genom üzerinde rastgele bölgelerde gerçekleşir. Bu rastgele mutasyonlar, genom boyunca dağıldığı için, gelişen fenotipik özelliğe, hangi değişikliğin sebep olduğunun belirlenmesi oldukça zordur. Bu gibi durumlarda, evrimsel mühendislik, o hücrenin metabolik ağının çözülmesine ciddi bir katkı sağlamayabilir. Ayrıca, genetik değişikliğin yeri bilinmediği için, kazanılan fenotipik özelliğin, genetik olarak diğer suşların aktarılması mümkün değildir. Yine de, evrimsel mühendislik, genetik modifikasyon ile fenotipik özellik arasında bir bağ kurar; bu sebeple tersine metabolik mühendislik için önemli bir başlangıç noktasının oluşturur. Bu bağlamda, evrimsel mühendislik, metabolik mühendisliğin diğer alanlarında kullanılmak üzere çok değerli başlangıç verilerinin elde edilmesini sağladığı için önemlidir. Bu çalışmada kobalt klorüre dirençli, mutant Rhodotorula spp. mayasının elde edilebilmesi için evrimsel mühendislik prosedürü uygulandı. Yaban tip suş olan C2.5t1’in genetik çeşitliliğini arttırmak amacıyla UV mutasyonu yapıldı. Eklenecek kobaltın başlangıç miktarına karar verebilmek için C2.5t1 ve UV’ye maruz kalmış hücrelerin farklı konsantrasyonlardaki CoCl2 stres koşullarında hayatta kalabilme özellikleri test edildi. Daha sonra, MutZ olarak adlandırılan UV ile muamele edilmiş C2.5t1 mutant popülasyonu seleksiyon deneylerinde kullanıldı. Basamak basamak kültive edilen MutZ hücrelerine sürekli CoCl2 stresi uygulandı ve her basamakta daha fazla miktarda CoCl2 eklendi. Elde edilen son mutant popülasyondan rastgele mutant koloniler seçildi. Elde edilen dört mutant koloni, yaban tip ile karşılaştırılarak karakterize edildi. İlk olarak, CoCl2 varlığında ve yokluğunda üreme özellikleri test edildi. Mutant hücreler en az 20 mM CoCl2 stresinde üreyebilirken, yaban tipin kobalt stresine maruz bırakıldığında üreyemediği gözlemlendi. Çapraz direnç kontrolü ile NaCl (8%), ZnSO4 (8 mM), CuSO4 (15 mM), MnSO4 (40 mM), FeSO4 (50 mM), H2O2 (5 mM), plumbagin (50 µM) ve ısı şoku (56°C’de 10 dakika) streslerine dirençleri analiz edildi. Ayrıca, kobalt varlığında üreme özellikleri değerlendirildi. Daha sonra, renk değişimleri belirlendi. Kobalta maruz kalmış hücreler koyu kahve renkteyken kobalt olmayan ortamda üreyen hücrelerin pembe renkte olduğu gözlemlendi. CoCl2 varlığında ve yokluğunda üretilen karotenoidler ekstrakte edildi ve kobalt içeren ortamda üreyen mutant hücrelerin kobalt içermeyenlere göre daha fazla, yaban tipe göre ise daha az karotenoid ürettiği tespit edildi. Rastgele seçilmiş tek kolonilerden Z121A mutantının renginin daha koyu olduğu ve daha fazla karotenoid ürettiği görüldü. Diğer taraftan, hücrelerin kobalt absorpsiyon özellikleri atomik absorpsiyon spektrofotometresi ile analiz edildi. Son olarak, mutantların CoCl2 stresine dirençlerinin kalıcı olup olmadığını belirlemek için genetik kararlılık deneyi yapıldı. Bu çalışmada kobalt stres koşulunda üreyip karotenoid üreten mutant hücrelerin elde edilmesi ve farklı özelliklerinin belirlenebilmesi için yaban tip ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Gelecekteki çalışmalarda bu mutant kullanılarak fizyolojik ve genetik karakterizasyonu yapılabilir ve elde edilecek veriler karotenoid üreten mayadaki bilinmeyen CoCl2 direnç mekanizmasının ve bu mekanizmanın karotenoid üretimi üzerindeki olası etkilerinin anlaşılmasına yardımcı olabilir.An evolutionary engineering strategy was employed to obtain cobalt chloride resistant Rhodotorula spp. mutant yeasts. UV mutagenesis was applied to increase genetic diversity of the initial population for selection. Viability of wild type strain C2.5t1 and UV treated cells were tested under different concentrations of CoCl2 to determine the initial cobalt stress level for selection. After that, UV-treated C2.5t1 mutant cells, named as MutZ, were utilized in evolutionary engineering experiment. Continuous CoCl2 stress was applied to MutZ cells during sequential cultivation and increased amounts CoCl2 were added at each cultivation during the selection procedure. At the end, single mutant colonies were selected randomly from the final mutant population grown on plates. Four evolved individual colonies were characterized as compared to the wild type. First of all, their growth performances with and without CoCl2 were tested. It was obviously seen that higher than 1 mM CoCl2 stress exert a strong inhibitory effect on growth of wild type however mutants could grow at least at 20 mM CoCl2 stress. They were analysed for their cross resistances against NaCl (8%), ZnSO4 (8 mM), CuSO4 (15 mM), MnSO4 (40 mM), FeSO4 (50 mM), H2O2 (5 mM), plumbagin (50 µM) and heat shock stress (56°C for 10 min). Moreover, their growth fitness in the presence of cobalt was evaluated. Later, colour differences were determined. It was recognised that cobalt treated cells have dark brown colour but untreated cells have pink colour. Carotenoids that were produced in the absence and presence of CoCl2 were extracted and it was decided that cobalt-treated mutants produced more carotenoid than untreated, less than the wild type. Z121A mutant had darker colour and higher carotenoid production than other randomly selected individual mutants. Furthermore, cobalt absorption abilities of the cells were analyzed by atomic absorption spectrophotometer. Finally, the genetic stability experiment was carried out to determine if the cobalt resistance trait was genetically stable. In this study, it was aimed to obtain carotenoid producing mutant cells resistant to cobalt stress conditions and then compare their features with the wild type to determine the differences. In future experiments, physiological and genetic characterization of the mutants could be done and it can help identify the unknown mechanism of CoCl2 resistance in carotenoid producing yeast, and its possible effects on carotenoid production.Yüksek LisansM.Sc