Physiological Investigation Of Rhodobacter Sphaeroides

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013Rhodobacter sphaeroides metabolik olarak geniş bir organizasyona sahip olan α-3 mor non-sülfür bir organizmadır. Oksijensiz ortamda R. sphaeroides hücreleri fotosentez, solunum ve fermantasyon yaparak çoğalabilir. R. sphaeroides hücrelerinde bulunan fotosentez yapımından sorumlu olan fotosentetik yapıları oksijenin varlığında oksijen tarafından zarara uğratıldığından fotosentez sadece oksijensiz ortamda meydana gelebilir. R. sphaeroides hücreleri fotosentezi fotoheterotrofik ve fotoototrofik olarak gerçekleştirebilir. R. sphaeroides hücreleri fotoheterotrofik fotosentezi organik bileşikleri hem karbon hem de indirgeyici element olarak kullanarak gerçekleştirirken, fotoototrofik fotosentezi ise karbondioksiti tek karbon kaynağı olarak ve hidrojeni de indirgeyici güç olarak kullanarak gerçekleştirir. R. sphaeroides’in genomu CI ve CII olmak üzere iki adet kromozomdan ve beş adet endojen plazmitten oluşur. R. sphaeroides genomunun ilk fiziksel haritalama neticesinde; CII kromozomunun protein sentezi, amino asit sentezi, yağ asidi metabolizması ve enerji metabolizmasında önemli bir yere sahip olan genleri kodladığı açığa çıkartılmıştır. R. sphaeroides biyoteknolojide hem endüstriyel, hem de tıbbi alanda kullanımı olan bir organizmadır. R. sphaeroides’in endüstriyel uygulamaları hidrojen gazı ve polihidroksibütirat üretimini ve ağır metallerin biyoremediasyonunu kapsar. Ayrıca B12 vitamini, coenzim Q10, 5-aminolevulinik asit ve porfirin üretimini de içermektedir. Diğer organizmalar gibi, R. sphaeroides hücreleri de kendi çevrelerinde sürekli olarak karşılaştıkları streslere cevap vermek amacıyla farklı stres çeşitleri için farklı savunma mekanizmalarını geliştirmiştir. R. sphaeroides’in kendini korumak için geliştirmiş olduğu savunma mekanizmaları karşılaştığı stres tipine göre değişebilir. Örneğin, hücre içerisinde fazla miktardaki madde yoğunluğu nedeniyle meydana getirilen ozmotik stres koşulu altında, R. sphaeroides ozmotik strese karşı bir anyonik fosfolipid olan ve bakteri hücrelerinde enerji dönüşümünde önemli role sahip olan kardiolipin seviyesini artırarak cevap verirken, serbest oksijen tarafından meydana getirilen oksidatif strese karşı ise bakteriye mor rengini veren ve antioksidant olarak da bilinen karotenoid molekülerinin miktarını artırarak yanıt verir. Oksidatif streste karotenoid moleküllerinin koruyucu fonksiyonunun yanı sıra, süperoksit dismutaz, katalaz ve peroksidaz gibi bileşenler de hücre içindeki reakif oksijen türlerini yok etmede önemli role sahiptirler. R. sphaeroides ağır metallerin bakteri hücreleri üzerine olan olumsuz etkileriyle başa çıkabilmek için, diğer bazı mikroorganizmalar gibi ağır metal direncini kazanabilmek amaçlı çeşitli stratejiler geliştirmiştir. Bu stratejilerden bazıları; enzimatik transformasyonu, bakterinin geçirgenlik bariyeri ile metallerin hücre dışında bırakılmasını yani bir şekilde bakteri hücreleri tarafından hücre içine alınmamasını, metallerin daha az toksik olan formlarına indirgenmesini ve metal iyonlarının bazı taşıyıcı proteinler aracılığı ile hücre içinden hücre dışına gönderilmesini kapsar. Bakteri hücreleri tarafından geliştirilen bir diğer strateji ise, ağır metal stresi altında bulunan bakteri hücrelerinin hücre yapısında bulunan lipid molekülündeki yağ asitlerinin bileşimini değiştirmesidir. R. sphaeroides metabolik olarak oldukça farklı ve neredeyse değişebilen her çevreye uyum gösterebilen bir organizmadır. Bu yüzden R. sphaeroides birçok bilim insanının dikkatini çekmiştir ve endüstriyel açıdan da önemli bir mikroorganizmadır. Ayrıca R. sphaeroides ağır metallerin biyoremediasyonu özelliği ile bilinmektedir. R. sphaeroides’ in bu özelliğinden yola çıkarak, R. sphaeroides’in ağır metal direnç mekanizmasını inceleyen çalışmalar literatürde mevcuttur. Ayrıca R. sphaeroides’in fotosentez mekanizmasının incelenmesi ve yine R. sphaeroides’i kullanarak hidrojen gazı üretimi ve polihidroksibütirat üretimi ile ilgili araştırmalar da söz konusudur. Doğada mikroorganizmalar, değişen çevre koşullarıyla birlikte sürekli olarak farklı stres çeşitleriyle yüzleşmek zorunda kalırlar. Bu nedenle mikroorganizmaların özellikle de endüstriyel öneme sahip olan mikroorganizmaların, çevrelerinde karşılaştıkları streslerin yüksek düzeylerine karşı dirençli olması istenilen bir özelliktir ve bu özelliği mikroorganizmalara kazandırma yönünde pek çok çalışma gerçekleştirilmektedir. Bu tez çalışmasında, herhangi bir mutasyon gerçekleştirmeksizin yaban tip R. sphaeroides R-26 hücreleri kullanıldı ve fizyolojik analizler, hem stres faktörü varlığı hem de stres faktörü yokluğunda gerçekleştirildi. Bu tez çalışmasında diğer streslerin (NaCl, etanol, H3BO3, H2O2 and CuSO4 gibi) yanısıra, R. sphaeroides’in olası kobalt direnci hakkında bilgi sahibi olabilmek için, özellikle R.sphaeroides’in kobalt direncinin belirlenmesi üzerine odaklanıldı. Fizyolojik incelemelerin parçası olarak mikrobiyal üreme eğrisi analizi ve hücre kuru ağırlığı tespiti, hem stres varlığında hem de stres yokluğunda gerçekleştirilmiştir. Üreme eğrisi grafiğini elde etmek için kullanılan optik yoğunluk değerleri aracılığıyla, maksimum spesifik üreme hızı da yine hem stres varlığı hem de stres yokluğu koşulları için hesaplanmıştır. Elde edilen üreme eğrisi analizi sonucuna göre; R. sphaeroides hücreleri herhangi bir stres faktörü içermeyen ortamda, stres faktörünü (CoCl2) içeren ortama göre daha iyi bir üreme göstermiş ve logaritmik evreye daha kısa sürede ulaştığı gözlemlenmiştir. Maksimum spesifik üreme hızı değeri ve hücre kuru ağırlık değeri de beklendiği gibi stres içermeyen ortamda stres içeren ortama göre daha yüksek çıkmıştır. Bu sonuçlar, kobaltın R. sphaeroides’in üremesi üzerindeki inhibe edici etkisini göstermektedir. Ayrıca, R. sphaeroides’in direnç mekanizmasını anlamak için ve ağır metallere karşı direnç ve hassasiyetini gözlemlemek için fenotipik karakterizasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. R. sphaeroides’in fenotipik karakterizasyonu öncelikli olarak CoCl2 ağır metal stresi için en muhtemel sayı (EMS) yöntemi, damlatma deneyi ve uygun optik dalga boyu değerini kullanarak optik yoğunluğun ölçümü ile gerçekleştirilirken, diğer stresler için ise koloni sayımı veya optik yoğunluk ölçümleriyle gerçekleştirilmiştir. Ağır metallere ve diğer stres faktörlerine karşı fenotipik karakterizasyon çalışmaları neticesinde; CoCl2’nın düşük konsantrasyonlarında R. sphaeroides hücrelerinde, yüksek CoCl2’ye kıyasla daha iyi üreme olduğu gözlemlenmiş ve fenotipik karakterizasyonu koloni sayımı yöntemi ile gerçekleştirilen diğer stres faktörlerine kıyasla R. sphaeroides hücrelerinin tuz stresine (NaCl) karşı daha dirençli olduğu görülmüştür. Ayrıca R. sphaeroides hücreleri bir ağır metal olan CoCl2 ve diğer stres faktörlerini içermeyen ortamda kendi doğal kırmızı-mor rengini sergilerken, CoCl2’ın yüksek konsantrasyonlarında CoCl2’nın açık pembe rengini almıştır. Bu sonuç, R. sphaeroides hücrelerinin CoCl2’yi tuttuğunu düşündürmektedir. Diğer ağır metal stresleri ve ağır metallerin dışındaki streslerin varlığında böyle bir bulguya rastlanmamıştır. Hücre örnekleriyle yapılacak kapsamlı metal tayinleri R. sphaeroides’in farklı metallerle olan ilişkisini anlama yönünde önemli bilgiler sağlayabilir. Bu tez kapsamında yapılan çalışmalar, R. sphaeroides’in fizyolojik özelliklerini ve stres direnç düzeylerini açığa çıkarmanın yanı sıra bu mikroorganizmanın stres direncini artırmak yönünde yapılacak olan çalışmalar için de yararlı olabilecektir.Rhodobacter sphaeroides is an α-3 purple non-sulfur eubacterium with an extensive metabolic organization. Under anaerobic conditions it is able to grow by performing photosynthesis, respiration and fermentation. Photosynthesis occurs only under anaerobic conditions since photosynthetic apparatus of R. sphaeroides is harmed in the presence of oxygen. Photosynthesis may be both photoheterotrophic and photoautotrophic. While R. sphaeroides performs photoheterotrophic photosynthesis using organic compounds as both a carbon and a reducing source, R. sphaeroides performs photoautrophic photosynthesis using carbon dioxide as the sole carbon source and hydrogen as the source of reducing power. In addition, R. sphaeroides can grow both chemoheterotrophically and chemoautotrophically. Regarding biotechnological applications, R. sphaeroides is used both in industry and in medicine. Industrial application of R. sphaeroides comprises hydrogen gas and polyhydroxybutyrate (PHB) production and bioremediation of heavy metals. R. sphaeroides can also be used in the production of vitamin B12, coenzyme Q10, 5-aminolevulinic acid (ALA) and porphyrin. Like other microorganisms, R. sphaeroides has different defence mechanisms to give response against different stress types that occurs frequently in its microenvironment. Defence mechanisms of R. sphaeroides vary according to the types of stress. For instance, while under osmotic stress condition, R. sphaeroides gives response by increasing cardiopilin levels which is an anionic phospholipid playing an important role in energy conversion in cells of R. sphaeroides, as for, under oxidative stress condition it gives response increasing its carotenoid levels. In addition to the protective role of carotenoid for oxidative stress, other components such as superoxide dismutase, catalases and peroxidases play also an important role in eliminating reactive oxygen species from the intracellular environment of R. sphaeroides. R. sphaeroides has improved metal stress resistance strategies to cope with unfavorable effects of heavy metals. These strategies comprise enzymatic transformation, exclusion by permeability barrier, reduction of metals to less toxic forms and efflux of the metal ions from the cell. Another strategy for improving heavy metal stress resistance is to alter the fatty acid composition of their lipid to maintain membrane integrity under heavy metal stress. Since R. sphaeroides is a metabolically highly diverse organism, it can become adapted to a variety of changing conditions. Because of that, it has drawn scientists’ attention. R. sphaeroides is a promising microorganism for future industrial and medical applications. In nature, microorganisms, continuously encounter different stress types in their environment. Scientists would like to improve stress resistance of industrially important microorganisms to increase their productivity and yield. A variety of studies on improvement of stress resistance in industrial microorganisms exist in the literature. In this study, the wild type R. sphaeroides R-26 was used as a model organism and its physiological analysis was performed both in the absence and the presence of stress factor. In this thesis study, cobalt tolerance of R. sphaeroides has been emphasized particularly, in addition to other heavy metals and other stresses such as NaCl, ethanol, H3BO3, H2O2 and CuSO4. Regarding physiological investigation of R. sphaeroides, growth curve analysis and cell dry weight determination studies were carried out. The maximum specific growth rate determination was performed using OD535 values that were used to obtain the growth curves for both in the absence and in the presence of stress factor. In conclusion, cells of R. sphaeroides which were not treated with CoCl2 could grow better than the cells treated with CoCl2. In addition, the results of cell dry weight analysis and determination of maximum specific growth rate confirmed growth rate analysis results, and hence, the inhibitory effect of CoCl2 on growth. Additionally, phenotypic characterization were performed to observe its resistance and sensitivity against heavy metals. While phenotypic characterization for CoCl2 stress was performed by applying MPN (Most Probable Number) method, spotting assay and monitoring optical density; colony counting or optical density measurement was used for other stresses. Phenotypic characterization results revealed that R. sphaeroides showed more tolerance against NaCl, among all other stress factors tested. This study revealed the general physiological characteristics and stress tolerance levels of R. sphaeroides and would be helpful for future studies to improve its stress tolerance.Yüksek LisansM.Sc