Identification Of Novel Interaction Partners Of Nuclear Factor I B

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013Nükleer faktör I (NFI) transkripsiyon faktörleri ailesi barındırdığı 4 üyesi ile birlikte yüksek oranda korunumlu ve merkezi sinir sistemi gelişiminde anahtar rol oynayan bir ailedir. Bir diğer ismi de CTF ya da CCAAT-bağlanma transkripsiyon faktörleri olan NFI ailesinin, tek hücreli organizmaların genomunda yer almamasından dolayı metazoalara spesifik olduğu söylenebilir. NFI ailesi temelde 4 gen (Nfia, Nfib, Nfic, ve Nfix) ile temsil edilmesine rağmen tek bir genden post-transkripsiyonel modifikasyon ile 9 adet ürün üretilebilmektedir. NFI ailesi üyelerinden üretilen tüm proteinler N-uçlu DNA-bağlanma/dimerleşme domeyni ve C-uçlu transkripsiyonel aktivasyon ya da represyon domeyni olmak üzere iki temel domain içermektedir. N-uçlu DNA-bağlanma/dimerleşme domeyni 200 aa uzunluğundadır. Yapısal olarak kendine hastır ve yalnızca SMAD proteinlerinin MH1 (Mad Homoloji) domeyni ile sekans homolojisi taşımaktadır. İnsan, fare ve tavuk NFI genleri arasında yüksek oranda korunmuş olmakla birlikte DNA’ya bağlanma, dimerleşme ve adenovirüs DNA’sını replikasyonu stimüle etme gibi görevleri mevcuttur. C-uçlu domeyn, yaklaşık yüzde yirmibeşinin prolin rezidülerinden ibaret olmasından ötürü prolince zengin domeyn olarak adlandırılır ve çoğunlukla NFI aracılı gen ekspresyonlarından sorumludur. N-uçlu domeynin tersine, C-uçlu domeyn NFI proteinleri arasında belirgin farklılıklar göstermektedir ve bu farklılıkların C-uçlu domeynin transkripsiyonel fonksiyonlarını belirlediği düşünülmektedir. Transfeksiyon çalışmalarıyla NFI-A ve NFI-X C-uçlu domeynlerinin transkripsiyonu baskıladığı görülmüştür. Ayrıca NFI proteinlerinin pek çok promotoru negatif olarak regüle ettiği görülmüştür. NFI proteinlerinin bu şekilde hem transkripsiyonu baskılama hem de aktifleştirme rolünün olmasından ötürü, bu proteinlerin aktifleştirme/baskılama mekanizmasının eksprese edildikleri hücre tipine ve bağlandıkları promotora bağlı olduğu düşünülmektedir. NFI proteinleri çift iplik DNA üzerinde TTGGC(N5)GCCAA dizisine bağlanmakta ve NFI proteinlerinin insan genomik DNA’sı üzerinde toplamda 75.000 bölgeye bağlandığı tahmin edilmektedir. NFI transkripsiyonel faktörleri ailesinin ilk olarak Adenovirus DNA’sının replikasyonundan sorumlu olduğu ve fare memeli tümör virüsünün transkripsiyonunda rol aldığı gösterilmiş, daha sonraları ise pek çok hücresel genin transkripsiyonunda ve ekspresyonunda görev aldığı anlaşılmıştır. NFI proteinlerinin ayrıca histon H1 ve H3 ile de etkileştiği gösterilmiştir. NFI mRNA’larının vücuttaki pek çok organda örtüşen şablonlarla eksprese edilmeleri bu proteinlerin fonksiyonel analizlerini karmaşık hale getirmektedir. NFI ailesi üyelerinden Nfib, akciğer epitelyumundaki genlerin ekspresyonu regüle etmesinden ötürü akciğer gelişiminde özel bir öneme sahiptir. NFI ailesinin bir diğer üyesi olan Nfia kalp, karaciğer, akciğer, yumurtalık, iskelet kası, böbrek, testis, pankreas, dalak, fetal karaciğer ve beyin gibi pek çok organda eksprese edilmektedir. Nfic ise özellikle diş kökü oluşumunda rol almaktadır. Gelişmekte olan beyinde önce nörogenez daha sonra gliogenez meydana gelmektedir. Nöral gelişimin bu sıralı yapısı dışsal sinyaller, farklı transkripsiyon ailesi faktörleri ve histon ile DNA’nın modifikasyonu tarafından kontrol edilmektedir. NFI transkripsiyon faktörleri ailesi de merkezi sinir sistemi gelişiminde glial ve nöronal hücre faklılaşmasına rehberlik eden önemli bir aktör konumundadır. Merkezi sinir sisteminin gelişimi sırasında meydana gelen nöron-glia geçişi tam anlaşılmış bir proses olmamakla birlikte Notch sinyalizasyon yolağının temel bir rol üstlendiği bilinmektedir. Ancak Notch yolağının aktif hale gelmesi nöral progenitör hücrelerinde Nfia ekspresyonuna bağlıdır. Nfia’nın bir diğer rolü de gliogenezin koordinasyonu için Sox9 proteini ile birlikte nörogenezi sabitlemesidir. Nfia, gliogenez ve oligodentrosit faklılaşmasını modüle etme görevini sadece beyinde değil gelişmekte olan omurilikte de yürütmektedir. Nfib-/- farede yapılan çalışmalar gelişmekte olan neokorteks ve hipokampüste glial gelişimde gecikme olduğunu göstermiştir. Bu da beyindeki glial gelişim sırasında Nfib’nin de görev aldığını ortaya koymaktadır. Anatomik açıdan bakıldığında, Nfia, Nfib, ve Nfix başlangıçta ventriküler bölgelerde ifade edilirken, geç embriyonik ve postnatal dönemlerde ise serebral korteks, hipokampus, beyincik, ve omurilik da ekspresyon yüksek olmaktadır. NFI proteinleri ayrıca beynin gelişim sürecindeki hücre göçünü de düzenlemektedirler. NFI ailesi üyeleri ayrıca kanser ve nörolojik hastalıklarla da ilişkilidir. NFI proteinlerinin tavuk embriyosu fibroblast hücrelerinde aşırı ekspresyonu yapıldığında fibroblast hücrelerini onkogenlerin transformasyonuna daha dirençli hale getirdiği görülmüştür. Spesifik olarak NFI-A geninin farklı kronik kötü huylu miyeloid hastalıklarıyla ilişkili olduğu ve NFIB’nin Adenoid kistik kanserindeki rolü gösterilmiştir. Meme kanserli dokularda NFIB proteininin ekspresyon sıklığı çalışılmış ve NFIB mRNA düzeyinin triple negatif meme kanserinde belirgin miktarda olduğu gözlenmiştir. Diğer taraftan NFIB geninin susturulmasının hücre çoğalmasında azalma ve apoptotik sinyal yolağında artışa yol açtığı gösterilmiştir. NFI ailesinin nörolojik hastalıklardaki rolüne bakıldığında Nfia geninin homozigot delesyonunun hayvanlarda %95 ölüme yol açtığı ve sağ kalanların da ciddi nörolojik kusurları olduğu gösterilmiştir. Yine Nfib-/- farede beyincik içerisinde gelişim defektleri tespit edilmiştir. Nfix geninin susturulduğu farelerde ise perinatal ölüm hidrosefalus, korpus kallosumun oluşum bozukluğu, beyin kütlesinde artış ve anormal hipokampüs oluşumu rapor edilmiştir. Bu tez çalışmasında Maya 2 Hibrid (M2H) tekniği kullanılarak insan fetal beyin kütüphanesinde Nfib3 proteininin bağlanma partnerleri araştırılmıştır. M2H sisteminde iki protein arasındaki etkileşim, bir transkripsiyon faktörünün yeniden inşa edilmesi ve devamında bu transkripsiyon faktörünün kontrolü altındaki haberci genlerin aktivasyonu ile tespit edilir. NFIB ile etkileşecek proteinlerin tespit edilesinde M2H tekniğinin seçilmiş olmasında tekniğin görece ucuz ve basit olması, aynı zamanda maya sistemlerinin yüksek ökaryotlarda rastlanan posttranslasyonel modifikasyonlara imkan tanıması rol oynamıştır. Bu tez projesinde “Matchmaker” M2H sistemi kullanılmıştır. Bu sistemde AUR1-C, HIS3, ADE2, MEL1 olmak üzere 4 adet haberci gen bulunmakta ve protein etkileşimlerini tespit etmek için sırasıyla Aureobasidin A antibiyotiğine dirençlilik, histidin amino asiti yoksunluğunun giderilmesi, adenin amino asiti yoksunluğunun giderilmesi ve X-α-Gal substratının parçalanarak mavi renk açığa çıkartılması esaslarından faydalanılmıştır. Bu projede öncelikle Nfib3 cDNA’sı ve Nfib3’ün kısaltılmış versiyonu olan NFIBΔ, pGBKT7 ekspresyon plazmidine klonlanmıştır. Sonrasında Nfib proteininin eksprese edildiği, Nfib fragmentlerinin mayaya toksik etki göstermediği ve ilgili haberci genleri otoaktive etmediği gibi bir dizi kontrol deneyi yapılmıştır. Bu kontrol deneyleri sırasında kısaltılmış versiyonun otoaktivasyon gösterdiği tespit edilmiş ve esas maya 2 hibrit taramalarına yalnızca Nfib3 tam fragmenti ile devam edilmiştir. Maya 2 hibrit taramaları için insan fetal cDNA kütüphanesi taşıyan ‘av’ maya suşu, Nfib3 cDNA’sı taşıyan ‘yem’ maya suşu ile 1 gün boyunca eşleştirilmiş ve elde edilen diploid mayalar petrilere ekilerek ilk seleksiyon AUR1-C ve MEL1 haberci genleri üzerinden gerçekleştirilmiştir. Sonrasında HIS3 ve ADE2 haberci genlerinin de katıldığı seleksiyon ve bunu takiben maya koloni PCR, restriksiyon kesimi, ve segregasyon analizi ile ‘gerçek etkileşim’lerin ortaya çıkartılması hedeflenmiştir. Son olarak, bulunan ekileşimlerin teyit edilmesi amacıyla bir eşleştirme çalışması daha yapılmıştır. Bu son deney ile elde edilen klonlar dizi analizine gönderilerek NFIB proteini ile etkileşen proteinlerin cDNA’sı tespit edilmiş ve veritabanlarıyla karşılaştırılarak bunların hangi genlere denk geldiği ortaya çıkarılmıştır.Nuclear factor I (NFI) family of transcriptional factors has four members (Nfia, Nfib, Nfic, and Nfix) and is a highly conserved gene family, which plays a key role in central nervous system development. These proteins are required for glial and neuronal cell differentiation and proper development of neuronal and glial populations in developing brain. By post-transcriptional processing many different splice variants can be produced from a single NFI gene and this creates additional heterogenity in NFI proteins. The typical NFI protein is composed of an N-terminal DNA-binding/dimerization domain and a C-terminal transcriptional activation and/or repression domain. The N-terminal domain is around 200 amino acids and responsible for DNA-binding activity, dimerization and the stimulation of adenovirus DNA replication. The C-terminal domain is referred to as a proline-rich activation domain and it is mostly responsible for regulation of gene expressions. NFI proteins bind to duplex DNA with TTGGC(N5)GCCAA palindromic motif. NFI proteins form either heterodimers or homodimers and bind DNA with similar affinity. During embryogenesis, NFI genes are expressed in distinct, overlapping patterns with high levels of expression of Nfia, Nfib, and Nfix in the developing central nervous system in ventricular zones. At late embryonic and early postnatal ages, expression is particularly high in the cerebral cortex, hippocampus, basilar pontine nuclei, cerebellum, and spinal cord. While NFI-A and NFI-B are expressed during early gliogenesis, NFI-X and NFI-C are expressed later during differentiation of astrocytes and control the expression of late astrocyte markers. NFI proteins also regulate the cell migration and terminal differentiation in the cerebellum and glia mediated cell migration in the hippocampus. NFI family members are also involved in neurological diseases and cancer. The yeast two-hybrid system is a genetic system wherein the interaction between two proteins of interest is detected via the reconstitution of a transcription factor and the subsequent activation of reporter genes under the control of this transcription factor. Since interacting partners of NFIB in developing brain have not been well studied we aimed at identifying NFIB binding proteins by screening a human fetal brain cDNA library with the yeast two hybrid technique. As a result, we identified 12 potential NFIB interacting proteins of NFIB in fetal brain library.Yüksek LisansM.Sc