Microbiota Analysis In Dishwashers By Using The Next Generation Sequencing

Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013Doğal kaynakların sınırlı olması sebebiyle beyaz eşya endüstrisinde enerjinin verimli kullanılmasını sağlayacak makineler tasarlanmaya başlanmıştır. Bu sebeple daha az enerji ve su sarfiyatı yapan bulaşık makineleri de üretilmektedir. Enerji sarfiyatını azaltmanın yanı sıra üretici firmalar maliyeti düşürme amaçlı da paslanmaz çelik gibi maliyeti yüksek materyaller yerine makinaların pek çok bölgesinde polipropilen gibi plastik malzemelere yönelmişlerdir. Ancak düşük sıcaklık, az su ile yıkamanın yanında bir de plastik malzemelerin kullanımı makinaların çeşitli bölgelerinde mikrobik oluşuma sebep olabileceğinden hijyen denetimi açısından ciddi bir tehlike oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı; evsel koşulda farklı kullanıcılara ait bulaşık makinalarının iç yüzeylerindeki mikrobial birikim için bir mikrobiota haritası oluşturmaktır. Bunun için kültürle yapmaksızın, klasik DNA dizi analiz tekniği olan Sanger DNA dizi analiz yönteminin yanı sıra yeni bir teknoloji olan yeni nesil DNA dizileme tekniklerinden Illumina firmasına ait Solexa teknolojisi kullanılarak 16S ve 18S ribozomal DNA veritabanlarindan yararlanılarak tür/cins analizi yapılmıştır. Makina yüzeylerinde oluşan mikrobiyal birikimlerin haritalanması amacıyla; evsel koşulda kullanılan iki adet bulaşık makinası temin edilerek farklı bölgelerinden örnekler alınmıştır. Müşteri koşulunda oluşan kontaminasyonların üretim sırasında meydana gelebilecek kontaminasyonlardan ayırt edilebilmesi amacıyla; fabrika çıkışından temin edilen kullanılmamış bir makine referans olarak incelenmiştir. Makine iç yüzeylerinin haritalanması sırasında ise, genel anlamda makineye su alımı sırasında karşılaşılabilecek kontaminasyonlar, yıkama prosesi boyunca karşılaşılabilecek kontaminasyonlar, sirkülasyon hattında oluşacak kontaminasyonlar ve tahliye olmak üzere toplam 4 ana başlıkta incelenmiştir. Su girişi hattı üzerinden alınan örneklerde; şebeke üzerinden gelebilecek kontaminasyonların, makine girişinde yer alan su yumuşatma ünitesinin bu kontaminasyonlar üzerindeki olası etkileri ve yıkama ortamına alınan suda bulunabilecek mikroorganizmaların belirlenmesi amaçlanmıştır. Yıkama ortamından alınan örneklerde; mutfak gereçleri ile bire bir temas eden ve su, sıcaklık ve deterjan gibi etkilere maruz kalan yıkama ortamındaki mikroorganizmaların belirlenmesi amaçlanmıştır. Mikroorganizma gelişiminin yüzey malzemesi ile yakından ilişkili olması sebebiyle; “Yıkama Ortamı” içerisinden alınan örnekler malzeme bazında paslanmaz çelik, polipropilen ve conta olmak üzere 3 başlıkta gruplandırılmıştır. Yıkama ortamına alınan suyun, bütün çevrim boyunca sirkülasyonun gerçekleştiği su sirkülasyon hattından alınan örneklerde ise; deterjan ve sıcaklık etkisine ek olarak sürekli olan su akışının mikrobiyal birikime etkisi incelenmiştir. Yıkama çevriminin ardından; deterjan, kir ve mikroorganizma gibi çeşitli safsızlık ve kirlilik kaynakları içeren son suyun tahliye edildiği hat üzerinde oluşabilecek mikrobiyal birikimlerin belirlenmesi amacıyla bu bölgeden örnek alınmıştır. Ancak bu bölgeden yıkama ortamına herhangi bir geri dönüşüm olmadığı için analizinden vazgeçilmiştir. Klasik mikrobiyoloji analizleri; analiz edilen mikroroganizma türüne bağlı olarak; uygun besiyeri, inkübasyon sıcaklığı ve süresi gibi parametrelere göre gerçekleştirilmektedir. Diğer taraftan evsel koşullarda oluşan kontaminasyonların belirlenmesi amacıyla yapılan bu çalışmada; analiz edilecek mikroorganizma türü bilinmediğinden klasik mikrobiyoloiji analizleri yetersiz kalmaktadır. Müşteri koşullarında kirlenmiş bulaşık makinalarında bulunan mikroorganizma türleri ve yaşam şartları hakkında bilgi sahibi olunamaması, uygun besiyerlerinin sağlanamayacak olması ve aynı zamanda bazı organizmaların canlılığını yitirmiş olabileceği gibi nedenlerle; klasik mikrobiyoloji analizleri yerine kültür bağımsız yöntemlerle birlikte moleküler biyoloji tekniklerinin kullanımının uygun olacağına karar verilmiştir. Mikroorganizmaların DNA dizilimine göre tanımlanmasına olanak sağlayan moleküler biyoloji tekniklerinden faydalanılarak; DNA ekstraksiyonu, DNA saflaştırılması, polimeraz zincir reaksiyonu, yeni nesil DNA dizi analizi ve biyoinformatik değerlendirme adımları gerçekleştirilmiştir. Biyoinformatik değerlendirmelerde; elde edilen her türe spesifik olan 16S ve 18S ribozomal DNA bölgeleri dizi analiz verileri uluslararası kullanılan 16S ve 18S rDNA veritabanlarıyla karşılaştırılarak bakteri ve maya – küf gibi mikroorganizmaların tür ve cins bazında tanımlaması gerçekleştirilmiştir. Üretim sonrasında temin edilen bulaşık makinası yüzeylerinde mikrobiyal açıdan düşük seviyede kirlilik içerdiği ve analiz edilen mikroorganizmaların su kaynaklı kontaminasyonlar olduğu belirlenmiştir. Müşteri tarafından kullanım sırasında kontaminasyona uğrayan iki bulaşık makinası incelendiğinde anlamlı olarak toplam 44 farklı mikroorganizma tür / cinsi ile karşılaşılmıştır. Bu mikroorganizmaların gram (-) ve gram (+) bakteriler ile mantar türü maya ve küf canlılarını içerdiği görülmüştür. Belirlenen mikroorganizma cinslerinin büyük oranda gram (-) bakteri ile maya-küf türü mikroorganizmalara ait olduğu belirlenmiştir. Belirlenen mikroorganizma türlerine yönelik yapılan literatür araştırmasında; bu mikroorganizmaların su, hava, gıda ve insan yolu ile bulaşık makinalarına bulaşmış olabileceği belirlenmiştir. Özellikle gıda kaynaklı kontaminasyonların müşterinin tüketim alışkanlıklarına bağlı olarak değişkenlik gösterdiği düşünülmektedir. Kaynaklara göre dağılım incelendiğinde; çeşitliliğin ağırlıklı olarak su ve gıda kontaminasyonlarından etkilendiği görülmektedir. Buna ek olarak; literatürde toprak kaynaklı olduğu belirtilen mikroorganizma türlerinin su ve/veya gıda yolu ile bulaşık makinasına taşındığı düşünülmektedir. Her iki bulaşık makinasında da belirlenen mikroorganizmaların büyük oranda fırsatçı patojen özellik gösterdiği, bağışıklığı zayıflamış kişilerde çeşitli enfeksiyonlara yol açabileceği ancak sağlıklı bireyler üzerinde belirgin bir risk teşkil etmediği belirlenmiştir. Belirlenen mikroorganizma türleri, izole edildiği yüzey ve bölgelere göre değerlendirildiğinde; şebeke giriş hortumunda gözlenen mikrobiyal çeşitliliğin; su yumuşatma ünitesinden çıktıktan sonra azaldığı gözlenmiştir. Bu durumun reçineden kaynaklandığı düşünülmektedir. Her iki bulaşık makinasında da paslanmaz çelik malzemenin kullanıldığı kapak, yan duvar ve metal süzgeç yüzeylerinde mikrobiyal kirliliğin diğer yüzeylere oranla çok düşük seviyelerde olduğu, diğer taraftan plastik temelli malzemelerin kullanıldığı pervane, mikrofiltre ve kabafiltre, conta yüzeylerinde mikroorganizma çeşitliliğinin çok geniş olduğu görülmüştür. Mantar türü bir mikroorganizma olan Candida sp.’nin her iki bulaşık makinasından alınan farklı örneklerde özellikle plastik yüzeylerde ortak olarak belirlendiği görülmüştür. Bulaşık makinalarına su girişi üzerinden alınan örneklerdeki mikroorganizma çeşitliliğinin su yumuşatma ünitesi çıkışında azaldığı gözlenmiştir. Düzenli olarak su akışına maruz kalan sirkülasyon hattında ve pervanelerin iç yüzeylerinden alınan örneklerde mikroorganizma çeşitliliğinin makinanın diğer bölgelerine göre daha düşük olduğu belirlenmiştir. Bu durumun su akışının mikroorganizma tutunmasına engel olabileceğinden kaynaklandığı düşünülmektedir. İki farklı tüketiciden temin edilen bulaşık makinalarından alınan 27 örnek değerlendirildiğinde; genel olarak mikroorganizma tipleri ve kaynakları benzer olsa da ortak olarak değerlendirilebilecek mikroorganizma türlerinin farklılık gösterdiği belirlenmiştir. Bu farklılığın; su ve gıda kontaminasyonlarının coğrafya, tüketici alışkanlığı ve kullanım şeklinden büyük oranda etkilenmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Makine yüzeylerinden izole edilen mikroorganizma türleri arasında sağlıklı bireyler üzerinde herhangi bir sağlık riskine neden olacak patojen türler belirlenmemiş, ancak bağışıklığı zayıflamış kişiler üzerinde enfeksiyonlara neden olabilecek fırsatçı patojenlerin varlığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmayla evsel bulaşık makinelerinin yüksek sıcaklık gibi zorlu şartlara sahip olmalarına rağmen farklı tip mikroorganizmalar için spesifik yaşam alanı oluşturabileceğini gösterdik. Özellikle polipropilen ve EPDM gibi plastik materyaller bakteriler ve küfler için uygun çevre sağlamaktadır. Bu yüzden enerji, para ve zaman tasarruflarının yanı sıra insan sağlığı için hijyen denetimi göz ardı edilmemelidir.White goods industries started to designed new machines that allow the use of energy – efficient due to the limited natural resources. Therefore, dishwasher and washing machines that consume less energy and water are manufactured. Besides energy saving, producers started to use polypropylene materials instead of stainless steel materials for decrasing costs. These polypropylene materials were started to use for several parts of white goods. Besides low temperatures and washing with less water, using plastic materials has allowed microbial growing at several regions of machines therefore these conditions have started to threaten hygiene. The aim of this study is to create a microbiota map for inside of household dishwashers through culture independent 16S and 18S ribosomal DNA analysis by using both Sanger sequencing and new technology: The next-generation sequencing Dishwashers are suggested more than hand dishwashing because high water temperatures, detergents with a high pH levels and long cleaning process can be supplied in dishwashers. Despite of these extreme conditions, dishwashers also have a risk of cross-contamination from the dishwater to dishware. Various investigations indicate that microorganisms especially extremophiles can survive in dishwater from both hand and machine dishwashing even with high temperature and pH levels. Many various techniques have been used to analyse microorganisms. Each of these methods has different features in the way of determination as identification, quantitation and characterization. Differential staining, flow cytometry, phage typing, protein analysis and comparison of DNA nucleotide sequences are the most used techniques for determination of microorganisms. These methods are known as traditional methods except methods based on protein and nucleotide sequences that are known as molecular methods. Traditional determination methods are easy, fast, and cost effective but they have some limitations. For example, highly similar species cannot be phenotypically differentiated and comparing databases are limited so accurate identification cannot be generally carried out. In the last 25 years, molecular methods overcome these limitations. Especially in the last three decades, new molecular methods have greatly improved in terms of rapidly detect, identify and classify microorganisms. These new developed techniques have also determined the taxonomic relationship between closely related genera and species. Identification by using molecular methods based on the comparison of the protein profiles or nucleic acid sequences (DNA, RNA) of microorganisms with data bases of known organisms. The molecular methods also allow detecting low concentrations of viable or non-viable microorganisms in both pure cultures and environmental samples such as soil, water etc. Genetic fingerprinting, metagenomics and proteogenomics that are molecular approaches, are essential for exploring and characterizing the huge amount microbial diversity and understanding their interactions with biotic and abiotic environmental factors. Constructing clone libraries by using phylogenetic markers such as 16S or 18S rRNA genes are the most common used methods for obtaining microbial community composition. On the other hand, constructing clone library and sequencing is rather expensive and labor intensive when compared to the other microbial identification methods. Because of this, time and budgets usually restrict the number of sequenced clones that are acquired from the samples. Phylogenetic marker gene used in construction of cloned library is mostly 16S rRNA genes for bacteria, while 18S rRNA genes for fungi. This step is followed by sequencing for identification. The most widely used sequencing method is dideoxynucleotide chain-terminating DNA sequencing method of Sanger which involves many steps. In this method, chain-terminator nucleotides are labeled with fluorescent dyes in a reaction where fragmented DNA, DNA sequencing primers and DNA polymerase take part. Then, labeled nucleotides are detected by capillary electrophoresis. However, in recent times, the next-generation sequencing techniques are more popular than Sanger sequencing because of saving money and time. Cloning step was casted away with this modern technology and sequence efficiency was increased. First technique of this new technology was commercialized by ROCHE in 2004. All high-throughput sequencing techniques aim to reduce the time, effort and cost of whole genome sequencing to a level where Human Genome Project can be applied on a routine basis for research and clinical implementations. Metagenomics studies have also achieved new grown borders by providing a cost-effective means of identifying the environmental microbial phylotypes because of next-generation sequencing technologies. Moreover, the cost of sequencing decreased more than doubling each year by developing of Next Generation Sequencing, outpaces Moore’s Law. In this study Solexa technology belongs to Illumina company was used for sequencing. Illumina acquiered Solexa technology so the Illumina/Solexa Genome Analyzer was the second platform after pyrosequencing to reach markets in early 2007. It has been the most commonly used platform for metagenomics and whole genome studies since 2007. Illumina has TruSeq chemistry that is based on sequencing – by – synthesis approach. In this system, four nucleotides each labeled with a different fluorescent dye are added by a special DNA polymerase enzyme. For this study, 2 used and an unused dishwashers were chosen to create microbiota map. Dishwasher environment has been categorized to four parts that are water inlet, washing area, water circulation line and drain for creating microbiota map. Also washing area was classified into three groups according to raw materials, which are stainless steel, polypropylene, ethylene propylene diene monomer (EPDM). Therefore, samples were chosen according to function and raw material of the surfaces. 22 samples have been taken from each of three dishwashers and UARR PCR has been set for each sample. However, qualified PCR products have not been obtained from each sample. Samples that have qualified PCR products and be significant for microbiota map were chosen for NGS. When the Miseq results of 27 samples were examined, 77 different species were determined. 44 significant species were found when the results were filtered according to present frequency and features of species. These organisms are gram (-) and gram (+) bacteria and fungi such as mold and yeast. However, the majority of identified microorganisms are consisted of gram (-) bacteria and fungi. Candida sp that is a yeast, has been determined in the most of regions. If the surfaces that have Candida sp., are evaluated based on raw material, is seen that Candida has been extracted from polypropylene and EPDM materials for both of dishwashers. We didnot come across Candida sp.on the stainless steel surfaces. Moreover, at the result of literature search for the species of identified organisms, these microorganisms are contaminated to dishwashers from tap water, air, food and human ways. Especially food contaminations can show changes due to food consumption. The majority of identified organisms are contaminated from water and foods. It is also thought that soil microorganisms are contaminated through foods. In conclusion, we have shown that domestic dishwashers can provide a specific habitat for different types of microorganisms despite of extreme conditions that are high temperature, detergents and mechanical movements. Especially plastic materials such as polypropylene and EPDM allow a suitable environment for bacteria and fungi. Therefore, hygiene for especially human health should be noted beside saving energy, saving money and saving time.Yüksek LisansM.Sc