Production And Characterization Of Monoclonal Antibody Against P60-katanin

Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2011Thesis (PhD) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2011Katanin çeşitli hücre tiplerinde mikrotubul yapısını düzenleyen başlıca proteinlerden biridir. Mikrotubulü kesen heterodimerik bir protein olan katanin, P60 ve P80 isimli altbirimlerinden oluşur. P60 altünitesi mikrotubulleri keser, P80 altünitesi ise mikrotubul kesilmesini kontrol eder. Katanin, mitoz-mayoz iğ ipliklerinin kısalması ve kesilmesi süreçlerini teşvik eder. Nöronlarda, P60-kataninin seviyesi aktif büyüyen aksonlarda, büyüyen nöronal uzantıların ucunda ve dendritogenezde çok yüksek bulunmuştur. P60-katanin inhibe edildiğinde, nöronal hücre gövdesinde ve mitoz-mayoz iğ iplikleri boyunca mikrotubul uzunluğu artar. Bu çalışmada, P60-katanin’e karşı ilk monoklonal antikor, 1G6, üretildi. Öncelikle, sıçan P60-kataninin belirli bir bölgesinden üretilen RecP60 (Recombinat P60-katanin) proteini, , Escherichia coli de exprese edildi ve antijen olarak kullanıldı. Hibridoma teknolojisi ile elde edilen monoklonal antikorlar, ELISA ile tarandıktan sonra western blotting ve immünositokimya yöntemlerinde analiz edildiler. Çalışmanın sonucunda, 1G6 monoklonal antikorunun western blotting ve immunositokimya yöntemlerinde endojen P60-katanini tanıdığı belirlendi. Monoklonal antikorlar kullanılacak yöntemlerin çeşitliliğini arttırırlar. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda P60-katanin poliklonal antikorları kullanılmaktaydı. P60’a karşı monoklonal antikorun hibridoma hücresinin, yani onu sınırsız üretebilen kaynağının elde elde edilmesi, P60-kataninin fonksiyonlarını araştırmak için büyük bir avantaj sağlayacaktır.Katanin is one of the key protein for organizing microtubular structure of a variety of cell types. It is a heterodimeric microtubule severing protein composed of two subunits, P60 and P80. The P60 subunit severs microtubules and P80 controls microtubule severing. Katanin promotes spindle-shortening and severing processes in mitotic and meiotic spindles. In neurons, the level of P60-katanin was found to be very high in actively growing axons and at the tips of growing neuronal processes and in dendritogenesis. Inhibition of P60-katanin increases microtubule length throughout the neuronal cell body and mitotic/meiotic spindles. In this study, we produced 1G6, the first monoclonal antibody against P60-katanin. Firstly, RecP60 (Recombinat P60-katanin) protein, which was produced based on a specific region of rat P60-katanin, was expressed in Escherichia coli and used as antigen. Monoclonal antibodies produced by hybridoma technology were screened with ELISA, and then analyzed in westernblotting and immunocytochemistry. At the end of the study, it was determined that 1G6 monoclonal antibody recognized the endogenous P60-katanin in western blotting and immunocytochemistry in which monoclonal antibody would increase the range of applications. Since P60-katanin polyclonal antibodies have been used in studies until now, obtaining the hybridoma cell, the unlimited source of a monoclonal antibody against P60, results in a great advantage to investigate P60-katanin’s functions.DoktoraPh