Construction Of Gfp Based Designer Proteins

Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2011Thesis (PhD) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2011Son yıllarda, yalnızca sert doku mühendisliğinde değil, aynı zamanda ileri malzeme ve sistemlerin üretiminde, anorganiklerin biyolojik yolla biyobenzetimsel sentez ve oluşumu oldukça ilgi çekmektedir. Bu çalışmada, genetik mühendisliği ile iyileştirilmiş proteinler kullanılarak malzemenin etiketlenmesi ve montaj için biyolojik yollara yönelmeye odaklandık. Anorganik malzemeyi özgül olarak hedefleyen ve biyolojik fonksiyonlarını sürdürmeye devam eden multifonksiyonel proteinler tasarladık. Burada, genetik mühendisliği uygulanmış yeşil floresan proteinlerinin tasarlanmasıyla, kalsiyum fosfat mineral ve metal yüzey/nanopartikül etkileşimlerine dayalı iki farklı durum çalışması seçtik. Kalsiyum fosfat bazlı biyomineralizasyon, kemik ve diş sert dokularının oluşumundaki anahtar rolü nedeniyle yaygın olarak çalışılmıştır. Bu nedenle, kalsiyum fosfat minerallerini hedefleyen ve biyomineralizasyonun görüntülenmesini mümkün kılan protein bazlı bir sistemi yani GFPuv-HABP’yi tasarladık. Çift fonksiyonlu proteinlerin floresan ve bağlanma aktiviteleri, sırasıyla floresan mikroskopi ve spektroskopi ile kuartz kristal mikrobalans sistemi kullanılarak karakterize edilmiştir. Biyoteknolojide, bölgeye özgül protein immobilizasyonu protein çipleri, biyosensörler ve mikroarrayler gibi etkin araçların üretiminde gereklidir. Geleneksel immobilizasyon yaklaşımları, proteinin fonsiyonel gurupları ile yüzey arasındaki etkileşimleri izleyen kontolsüz toplanma sebebiyle protein aktivitesinde düşüşe neden olabilir. Burada, anorganiklere bağlanan peptidlerin, fonksiyonel protein GFPuv’nin düz yüzey ya da nanopartikül şeklinde farklı formlardaki gümüş ve altın substrata immobilizasyonunda kullanılmasında, peptit bazlı montajından faydalanılmıştır. Bifonksiyonel proteinlerin nanopartiküllere bağlanması ve floresan sönüm/artma etkinliği arasındaki korelasyon değerlendirilmiştir.In recent years, not only in hard tissue engineering but also in producing advance materials and systems, biomimetic synthesis and formation of inorganics using biological routes have attracted a great interest. In this study, we focused on addressing biological routes for materials labelling and assembly using genetically engineered proteins. We designed multifunctional proteins that can target inorganic materials specifically and still carry their biological functionality. Here, we selected two different case study based on calcium phosphate mineral, and metal surface/NP interactions through designing engineered green fluorescence proteins. Calcium phosphate based biomineralization is studied extensively due to its key role in the bone and dental hard tissue formation. We therefore, designed a protein based system that can target calcium phosphate minerals and allows monitoring of biomineralization, namely GFPuv-HABP. Fluorescence and binding activities of bi-functional proteins were characterized using fluorescence microscopy and spectroscopy, and quartz crystal microbalance system, respectively. In biotechnology, site-specific protein immobilization is required for the fabrication of efficient tools such as protein chips, biosensors and microarrays. The conventional immobilization approaches may cause a decrease in protein activity due to the uncontrolled assembly following interaction between functional groups of the protein and the surface. Here we employed peptide based assembly where inorganic binding peptides were used for the directed immobilization of a functional protein GFPuv on silver and gold substrates with different forms, as flat surfaces and nanoaprticles. The correlation between the binding of bifunctional proteins to nanoparticles and fluorescence quenching/enhancement efficiency was evaluated.DoktoraPh