Membrane Protein-based In Vitro Methods

Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013Thesis (PhD) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013Lipitleri, karbohidratları ve proteinleri içeren biyolojik zarlar yalnızca birkaç nanometre kalınlığında ve yüksek karmaşıklıkta yapılardır. Zar proteinleri, molekül taşınması, biyolojik enerji dönüşümü, hücresel davranış, iletişim ve tanıma gibi hücre yapı ve fonksiyonlarında birçok önemli göreve sahiptir. Bu yüzden, zar protein yapı ve fonksiyonundaki sorunlar hücre işlevlerinde problemlere yolaçar ve bu durum diyabetten kansere kadar birçok hastalığa neden olur. Zar proteinleri bu nedenle birçok ilacın hedefi konumundadır. Zar protein yapı ve fonksiyonunu araştırmak için hücre zarını taklit eden sistemler gereklidir. Model zar sistemleri, in vitro zar protein araştırma platformaları oluşturmak için önemli bir olanak sunar. En önemli model zar platformlarından biri olan yüzeye bağlı lipit çift-katman zar sistemi geniş integral proteinlerin lipit çift-katman içerisine yerleştirilebilmesi için gerekli bir aralık içerir. Bu tezin amacı, çoklu-ilaç direnci proteini (MDR1) gibi geniş hücre dışı ve içi bölümleri olan zar proteinlerinin fonksiyonel entegrasyonunda kullanılabilecek bir yapay lipit çift-katman sistemi kurmaktır. Bunun için kurulan lipit çift-katman sistemi karakterize edildi ve ilaç-zar protein etkileşimlerinin incelenmesindeki performansı in vitro koşullarda statin-tabanlı ilaçlar kullanılarak belirlendi. Yapay zar sistemi kurmak için, altın-kaplı cam ve kuvars kristal yüzeyler destek materyal olarak kullanıldı. Yapısında bulunan disülfit bağını koparıp kovalent olarak altın-kaplı yüzeylere bağlanan ve sonraki modifikasyonlar için diğer uçta aktif bir süksinimid sunan 3,3′-ditiyobis(N-süksinimid propionat) (DTSP) molekülü kullanılarak yüzeyler ilk önce aktive edildi. Geniş zar proteinlerinin lipit zarlara entegrasyonunda zar ile altın-kaplı destek arasında boşluk oluşturmak için modifiye edilmiş lipid molekülü (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polietilenglikol)-2000] (DSPE-PEG)) aracı molekül olarak kullanıldı. Hayvan ve bitki hücrelerinde yüksek miktarda bulunduğundan fosfatidilkolin molekülü lipozom solüsyonun hazırlanması için kullanıldı ve 100 nm çaplı lipozomlar ekstrüder sistem ile oluşturuldu. Her bağlanma olayını ve proteinli ve proteinsiz lipozomların lipit çift-katman oluşturmalarını gerçek zamanlı izlemek için Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) ve Kuvars Kristal Mikroterazi-Disipasyon (QCM-D) karakterizasyon metotları kullanıldı. Ayrıca, yapay lipit zar platformu sıvı-Atomik Güç Mikroskopi (AFM) sistemi uygulanılarak görüntülendi ve böylelikle, lipit katman topografisi incelendi. Ek olarak, ilaç-protein etkileşimleri kurulan yüzeye bağlı lipit çift-katman platformunda araştırıldı. Aracı molekülü yüzeye bağlamak için çeşitli DSPE-PEG derişimleri (0.01 – 0.06 mg/mL) denendi ve karakterizasyon deneylerinde (SPR ve QCM-D) yüzeye bağlanan DSPE-PEG miktarının yüksek başlangıç derişimi ile arttığı bulundu. Aracı moleküllerin yüzeyde aldığı konformasyonlar farklı DSPE-PEG yüzey kaplaması durumlarında çeşitlilik gösterdi. Örneğin, yüzeyin düşük miktarda kaplanması molekül içi etkileşimleri (mantar tipi yapı oluşumu) avantajlı hale getirirken, yüzeyin yüksek oranda kaplanması, ile DSPE-PEG moleküllerinin moleküller arası etkileşimlere (fırça tipi yapı oluşumu) girdiği görüldü. Karakterizasyon metotlarında bu şekilde bir konformasyonel geçişin varlığı 0.01 ve 0.02 mg/mL derişimleriyle oluşturulan yüzeylerde tespit edildi. Yüksek (0.05 ve 0.06 mg/mL) ve düşük (0.02 ve 0.03 mg/mL) DSPE-PEG derişimleri test edildiğinde kayda değer bir lipit katman oluşumu gözlenmedi. SPR ve QCM-D çalışmalarının her ikisinde de 0.03 mg/mL DSPE-PEG derişimi lipit çift-katman oluşumu için optimum koşulları sağladı. Sıvı-AFM sistemi kullanılarak aracı molekülün yapısal konformasyonu karakterize edildi. Aracı molekülün konformasyonel davranışını farklı koşullarda incelemek için DSPE-PEG kaplı katman öncelikle kurutuldu ve sonra tekrar ıslatıldı. Kurutma işlemi sonucunda yüzeyde küresel yapılar gözlendi. Bu durum, kurulan katmanın pürüzlülük parametresini arttırdı. Bu katman tekrar sulu ortama konulduğunda aracı molekülün önceki şeklini aldığı tespit edildi ve böylelikle, DSPE-PEG katmanının sonraki aşamalar için hazırlanıp kuru saklanabileceği tespit edildi. Ek olarak, oluşturulan aracı molekül katmanın boyutu incelenerek sıvı koşullarda bu katmanın daha yoğun ve yönlenmiş bir davranış ortaya koyduğu gözlemlendi. Aracı molekül katmanının bu yönlenmiş davranışı lipozomların deformasyonunu sağlayarak lipit çift-katmanı oluşturmasını ve bu katmanın yüzeyden yükseltilmesini sağladığı tespit edildi. Ayrıca, modifiye edilmemiş altın-kaplı yüzeylerin pürüzlülük parametreleri aracı molekülün bağlanmasından sonra belirgin bir şekilde azaldı ve daha düz bir yüzey elde edildi. Pürüzlülük parametresindeki bu azalmanın aracı moleküldeki PEG altbirimlerinin vizkoelastik özelliklerinden dolayı olduğu düşünüldü. DSPE-PEG derişiminin lipozomların bağlanma/yayılma ve lipit çift-katman oluşturması üzerindeki etkisini incelemek için sabit hacim ve derişimdeki lipozom solüsyonları kullanıldı. Aracı molekülün derişimi lipit katman platformunun kurulmasını kayda değer bir biçimde etkiledi. SPR ve QCM-D analizleri ışığında 0.03 mg/mL DSPE-PEG derişiminin kullanıldığında lipozom deformasyonu ve lipit katman oluşumu için optimum koşullar sağlandı. Diğer aracı molekül derişimleri test edildiğinde ya lipozom deformasyonunun olmadığı ya da kısmi deformasyonun gerçekleştiği gözlemlendi. Bu nedenle, lipit çift-katman platformunun kurulması için deneylere 0.03 mg/mL DSPE-PEG derişimi kullanılarak devam edildi. Lipit çift-katman yapısını görüntülemek için sıvı-AFM sisteminden yararlanıldı. AFM çalışmalarında lipozom yayılmasından sonra pürüzlülük parametrelerinin azaldığı (0.683 nm ve 0.776 nm’den 0.452 nm ve 0.555 nm’ye) ve daha düz bir yüzeyin oluştuğu gözlemlendi. Böylelikle, kurulan katmanın destek yüzey üzerinde lipit çift-katman oluştuğu AFM analizi ile de gösterildi. Zar proteinlerinin lipit çift-katman içerisine entegrasyonunu araştırmak için MDR1 proteini model protein olarak kullanıldı. SPR ve QCM-D metotları kullanılarak çeşitli MDR1 protein miktarlarında (0.7 - 5.0 µL) deneyler yapıldı. Optik kalınlık ölçümleri 1 µL MDR1 protein-yüklü lipozomların yüksek bağlanma/yayılma ile sonuçlandığını gösterdi. Ayrıca, disipasyon analizi SPR’dan elde edilen sonuçları destekledi. QCM-D analizi MDR1 proteini varlığında lipit katmanın akışkanlığının azaldığını gösterdi. Bu durumun doğal hücresel zarlarda olduğu gibi fosfolipitlerin hareketlerinin kısıtlanmasından kaynaklandığı düşünüldü. MDR1-yüklü lipit çift-katmanları görüntülemek için sıvı-AFM analizi yapıldı. Oluşturulan lipit katman üzerinde yaklaşık 1.2 - 2.8 nm yükseklikte birçok belirgin yükselti tespit edildi. Bu sonuçlar MDR1 proteininin sitoplazma dışındaki bölgesi için deneysel ve teorik değerlerin (2 nm) benzer olduğunu ve SPR ve QCM-D’den elde edilen sonuçları desteklediğini göstermektedir. Ayrıca, oluşturulan lipit katman içerisindeki MDR1 proteininin entegrasyonunu ve oryantasyonunu belirlemek için anti-MDR1 ve anti-Pin8 monoklonal antikor çalışmaları yapıldı. Antikor çalışmaları ışığında, MDR1 proteininin lipit katmanlar içerisine doğal yapısında farkedilebilen herhangi bir bozulma olmadan başarılı ve etkili bir biçimde yerleştirildiği gözlemlendi. İlaç-zar proteini etkileşimlerini incelemek için statin-tabanlı ilaçlar kullanıldı. Suda çözünebilme özelliğinden dolayı pravastatin molekülü deneyler için seçildi. Lipofilik ve polar olmayan özellikteki diğer statin-tabanlı ilaçlar (örneğin, simvastatin ve lovastatin) lipit çift-katman yapısını etkilediğinden dolayı deneylerde kullanılamadı. Pravastatin-MDR1 protein etkileşiminin araştırıldığı bu deneylerde bağlanma miktarı ilaç derişimine bağlı olarak (0.01 ve 0.05 mg/mL) arttı. Bu tezde, hücre içi ve dışında geniş bölgeleri olan MDR1 proteini için yüzeye bağlı yapay lipit platformu başarıyla kuruldu. Ayrıca bu platformda statin-tabanlı ilaçlar ve MDR1 proteini arasındaki etkileşimler incelendi. Literatürde statin-tabanlı ilaçlar ve MDR1 proteini arasındaki etkileşimlerin model zar sistemlerinde çalışıldığı herhangi bir ön çalışma bulunmamaktadır. Bu tezde statin-MDR1 proteini etkileşimleri yapay lipit zar platformu kullanılarak yeni bir yöntemle in vitro koşullarda incelenerek bu alandaki çalışmalara bir yenilik kattı. Ayrıca, yüzeye bağlı yapay lipit çift-katman sistemi zar proteininin doğal yapısında herhangi bir değişim oluşturmadığından protein karakteristiği ve ilaç-zar protein etkileşimleri çalışmaları için büyük umut vaad etmektedir ve böylelikle, kurulan platform hücre içinde ve dışında geniş bölgeleri olan zar proteinlerinin araştırılmasındaki sorunları çözebilen alternatif bir sistem sunmuştur. Ek olarak, yapay lipit çift-katman platformu ile mikro-akışkan ve biyosensör sistemleri birlikte kullanılarak farklı zar proteinleri ile çeşitli ilaçların in vitro koşullarda etkileşimlerinin incelemesini sağlayan çok amaçlı platformlar gelecekte oluşturulabilir.Biological membranes, which consist of lipids, carbohydrates and proteins, are only a few nanometers thick and highly complex structures. Membrane proteins have several crucial roles in cell structure and functionality such as molecule transportation, biological energy conversion, cellular behavior, communication, and recognition. Thus, problems in the membrane protein structure and function result in deficiencies in cell processes and dysfunctions in product formation, and these problematic cases cause a number of diseases from diabetes to cancer. These proteins are therefore targets of many drugs. To investigate membrane protein structure and function, design of cell membrane mimicking systems are essential. Model membrane systems offer a great opportunity to form in vitro membrane protein research platforms. Tethered lipid bilayer membrane platform, which is one of the most important model membrane systems, generates an extra space for the integration of large integral proteins into lipid bilayers. The aim of the thesis is to construct an artificial lipid bilayer system, which could be used in the functional integration of membrane proteins with large domains such as multi-drug resistance protein 1 (MDR1). For this, the constructed lipid bilayer system was characterized and its performance in the drug-membrane protein interactions in vitro conditions was evaluated using statin-based drugs. For constructing an artificial membrane system, gold-coated glass and quartz crystal surfaces were used as support materials. The surfaces were first activated using 3,3′-Dithiodipropionic acid di(N-hydroxysuccinimide) (DTSP) molecule, which breaks its disulphide bond to covalently bind to gold-coated surfaces, and presents an active succinimide group at the other end for further modifications. To generate a reservoir between lipid membranes and gold-coated support surfaces for the insertion of large membrane proteins, a modified lipid (i.e., 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG)) was used as a spacer molecule. Phosphatidylcholine molecule was used to prepare liposome solution due to its high abundance in animal and plant cells, and liposomes with 100 nm diameters were produced using an extruder system. To evaluate each binding events and lipid bilayer formation of protein-free and protein-loaded liposomes, Surface Plasmon Resonance (SPR) and Quartz Crystal Microbalance-Dissipation (QCM-D) methods were used. The artificial lipid membrane platform was further characterized using liquid-Atomic Force Microscopy system, and thus, the topology of the lipid layer was evaluated. Additionally, drug-protein interactions were investigated on the constructed tethered lipid bilayer platform. To attach the spacer layer, a broad range of DSPE-PEG concentrations (0.01 to 0.06 mg/mL) were tried, and the binding of DSPE-PEG molecule was found to increase with the increased concentrations according to the characterization experiments (i.e., SPR and QCM-D). The molecular arrangement of spacer varies in different PEG surface coverages. For instance, low surface coverages demonstrated higher intramolecular interactions (mushroom-like regime) whereas in high coverages, they interact with other PEG chains, and generate intermolecular interactions (brush-like regime). Characterization methods demonstrated that this conformational transition likely to occur between 0.01 and 0.02 mg/mL concentrations. A significant lipid layer formation was not observed when high (0.05 and 0.06 mg/mL) and low (0.02 and 0.03 mg/mL) concentrations of DSPE-PEG molecule were tested. Both SPR and QCM-D experiments implied that 0.03 mg/mL of DSPE-PEG concentration provided optimum conditions to form lipid bilayer structure. The structural conformation of spacer molecule was visually evaluated using liquid-AFM system. Condensed structure and directional behavior of spacer molecule was observed under aqeous conditions. To evaluate the rewettability of spacer molecule, DSPE-PEG coated layer was first dried, and then re-hydrated. Drying procedure caused the spacer molecule to be in collapse structure, and it increased the roughness parameters of the constructed layer. By re-hydration, uniform coating of the spacer molecule on support surface was observed again, and thus, the constructed layer assumed its previous shape. This presented an advantage for the designed platform since it allows the dry storage of the first layer till the construction of the whole platform for further experiments. In addition, the dimension of the constructed spacer layer was investigated, and spacer molecules presented more condensed and directional behavior in aqueous condition. The directional behaviors of spacer molecule possibly aided to not only lift the lipid layer from the surface, and also, deform the liposomes to form a lipid bilayer structure on the surface. Moreover, the viscoelastic features of PEG residues in spacer molecule significantly decreased the roughness parameters of the unmodified gold-coated surfaces, and presented more flat surface for lipid bilayer construction steps. To determine liposome binding/spreading and lipid bilayer formation, the effect of DSPE-PEG concentration was evaluated with a fixed volume and concentration of liposomes. Spacer concentration significantly affected the construction of lipid layer platform. QCM-D analysis indicated liposome deformation and the formation of flattened structure at optimum DSPE-PEG concentration (0.03 mg/mL). Non-deformation or partially deformation of liposomes was observed when the other spacer concentrations were tested, and the construction of lipid bilayer platform was continued using 0.03 mg/mL of DSPE-PEG concentration. To visualize the lipid bilayer structure, liquid-AFM system was performed, and it was observed that the overall roughness parameters decreased, and more flat surface (0.452 nm as compared to 0.683 nm) were visualized after the liposome spreading. Thus, AFM analysis of the constructed layer supported the results obtained by QCM-D experiments, and indicated lipid bilayer formation. To evaluate the integration of membrane proteins into lipid bilayer, MDR1 protein was used as a model protein, and a broad range of MDR1 amounts (0.7 to 5.0 µL) was analyzed using both SPR and QCM-D methods. Optical thickness measurements demonstrated that 1 µL of MDR1-loaded liposomes resulted in the highest binding/spreading. Further, dissipation analysis supported the results obtained by SPR, and it indicated that 1 µL of MDR1 protein amount provided optimum conditions for lipid layer formation. Further observations on QCM-D analysis demonstrated that lipid layer fluidity decreased when MDR1 protein was used, since the mobility of phospholipids was restricted in the presence of a large protein, as in natural cellular membranes. To visualize MDR1 protein-incorporated lipid bilayers, liquid-AFM analysis was used, and several jut-outs with ca. 1.2 – 2.8 nm in height were observed on the constructed layer. Theoretical dimensions of the exoplasmic regions of MDR1 protein in lipid bilayers are reported as ca. 2 nm in literature. Therefore, the experimental and theoretical results for the exoplasmic section of the membrane protein were observed to be comparable, and AFM analysis supported the results obtained by both SPR and QCM-D. Moreover, anti-MDR1 and anti-Pin8 mouse monoclonal antibody binding studies were performed to evaluate the integration and orientation of MDR1 protein in the constructed lipid bilayer platform. Upon the light of the antibody studies, the integration and correct orientation of MDR1 protein was observed, and thus, MDR1 protein was successfully and efficiently inserted into the lipid bilayers without any observable damage on the native structure of protein. To investigate drug-membrane protein interactions, statin-based drugs were used. Due to its solubility in water, pravastatin molecule was selected for the experiments, and the other statin-based drugs (e.g., simvastatin and lovastatin) were eliminated because of their lipophilic and non-polar properties, which interfere with the stability of lipid bilayers. As the result of pravastatin-MDR1 protein interaction, it was observed that the optical thickness parameter increased with increased pravastatin concentrations in a concentration dependent manner (i.e., 0.01 and 0.05 mg/mL). In this thesis, an artificial lipid bilayer platform was successfully constructed for MDR1 protein, which has extra- or intracellular domains, and the interactions between statin-based drugs and MDR1 protein were investigated. Until now, there is no other study to investigate the interactions between statin-based drugs and MDR1 protein on model membrane systems in literature, and thus, artificial lipid membrane platform offers a novelty to investigate these interactions in vitro conditions. Further, the presented lipid bilayer platform holds a great promise to be used in membrane protein characteristics and drug-membrane protein interactions without any alteration on the native protein structure. Therefore, the constructed platform is an alternative system to address the challenges in membrane protein research for large membrane-spanning proteins. Further, this platform could be tailored to be integrated with microfluidics and biosensor systems, and it could provide multipurpose platforms to investigate with different membrane proteins and drugs in vitro conditions.DoktoraPh